KAPA 마우스 유전자형 분석 키트 자주 묻는 질문

KAPA 마우스 유전자형 분석 키트는 마우스 조직에서 DNA를 신속하게 추출하고 증폭하는 데 필요한 모든 것을 포함합니다:

• KAPA 익스프레스 추출제는 유기 용매 없이, pH 중화나 원심분리 없이 15분 만에 추출을 완료합니다.
• KAPA2G Fast Genotyping Mix는 높은 진행성과 고속을 위해 설계된 새로운 DNA 중합효소를 사용하여 45분 증폭을 가능하게 합니다.
• 편리한 마스터 믹스 형식으로 제공되며, 로딩 염료가 포함되어 있고 핫 스타트 및 논-핫 스타트 제형으로 선택 가능합니다.

KAPA 마우스 유전자형 분석 키트에는 마우스 조직에서 단 15분 만에 PCR 준비 DNA를 추출할 수 있는 새로운 내열성 프로테아제 및 완충 시스템인 KAPA Express Extract와, 높은 진행성과 극도의 속도를 위해 유도 진화 과정을 통해 설계된 DNA 중합효소를 함유한 염료 포함 KAPA2G Fast Genotyping Mix가 포함됩니다.

추출 시 마우스 꼬리 조직의 약 2mm³ 크기 조각 또는 귀 조직의 2mm² 크기의 펀치 조직을 채취해야 합니다.

아니요, 조직은 프로테이나제 K 분해와 달리 완전히 분해되지 않습니다. 이는 정상적인 현상이며 용해 실패를 의미하지 않습니다.

Express Extract를 이용한 추출의 조잡한 특성으로 인해 PCR 전 정량 분석은 유의미한 정보를 제공하지 못합니다. 대신, PCR에 1 µL의 조추출물을 사용하기 시작하십시오(잠재적 억제제 제거를 위해 TE 또는 10 mM Tris-HCl, pH 8.0–8.5로 1:10 희석하는 것이 바람직함). 초기 실험 후 필요에 따라 양을 증감하십시오.

원심분리 단계는 선택 사항입니다. 용해물을 장기간 보관할 경우, 완충 용액으로 희석하기 전에 원심분리 후 상층액을 새 튜브로 옮기는 것이 권장됩니다. 반응 생성물을 고속으로 1분간 원심분리하면 잔여물을 침전시키기에 충분하며, 상층액을 쉽게 회수할 수 있습니다. 경우에 따라 잔여물이 침전되지 않고 추출액 전체에 현탁된 상태로 남아 있을 수 있습니다. 이 경우 DNA가 포함된 액체를 신중하게 새 튜브로 옮겨 후속 작업 및 보관을 진행하는 것이 좋습니다.

희석하지 않은 용해물을 사용할 경우, 한 번의 추출로 최대 100×25 µL PCR에 충분한 템플릿을 얻을 수 있습니다. 시작점으로 25 µL 반응당 1 µL의 DNA 추출물을 사용하십시오.

• 75°C에서 용해 시간을 15분으로 늘려 DNA 방출을 개선하십시오
• PCR 전 DNA 추출물을 TE 또는 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5)로 희석하십시오
• 최소 40회 이상의 PCR 사이클을 사용하십시오
• 연장 시간을 사이클당 20초 또는 30초로 늘리십시오
• 애닐링 온도를 2°C–5°C 낮추되, 50°C 이하로 내려가지 마십시오
• 추출 과정에서 조직이 완충액에 완전히 잠기도록 하십시오

• PCR 주기 수를 35회 이하로 줄이십시오
• 애닐링 시간을 15초로, 연장 시간을 사이클당 5~10초로 줄이십시오
• 애닐링 온도를 2~5°C 높임
• 신선한 프라이머 스톡을 준비하십시오

대부분의 1kb 미만 증폭산물에는 10초/kb가 권장됩니다. 낮은 수율로 증폭되는 증폭산물에는 연장 시간을 최대 30초/kb까지 늘릴 수 있습니다. 단편 분석이나 TA 클로닝 벡터로의 클로닝을 위해 3'-dA 꼬리 부착이 필요한 경우에만 최종 연장이 필요합니다.

모든 PCR 검사에 대한 최적의 어닐링 온도는 특정 템플릿-프라이머 조합에 따라 달라집니다. 최적의 결과를 얻으려면 프라이머를 설계할 때 어닐링 온도가 55~60°C 사이가 되도록 하십시오. 더 낮은 어닐링 온도의 프라이머를 사용할 수는 있으나, 50°C 미만의 어닐링 온도는 권장하지 않습니다. 어닐링 시간은 사이클당 15초를 초과하지 마십시오. 이를 초과할 경우 비특이적 증폭 및/또는 스미어링이 발생할 수 있습니다.

최적의 사이클 수는 템플릿 농도에 따라 달라집니다. 35회로 시작한 후 필요에 따라 늘리거나 줄이십시오.

KAPA Fast Genotyping Mix에는 1X 농도 1.5 mM의 MgCl₂가 포함되어 있습니다. 최적의 결과를 위해 필요한 경우 추가 MgCl₂를 첨가할 수 있습니다(1.5 mM 초과 시 0.5 mM MgCl₂당 25 mM 저장액 0.5 µL).

KAPA2G Fast HotStart 유전자형 분석 혼합액에는 KAPA2G Fast DNA 중합효소와 최초 변성 단계까지 효소를 비활성화하는 독점 항체가 포함되어 있습니다. 이는 반응 설정 및 시작 단계에서 비특이적 프라이밍으로 인한 불필요한 증폭 산물을 제거하고, 전체 반응 효율과 민감도를 높입니다. 핫스타트 혼합액이 아닌 혼합액으로 작업할 때는 PCR 설정 시 반드시 얼음 위에서 작업해야 합니다.

KAPA2G 고속 유전자형 분석 믹스에 포함된 염료는 PCR 직후 PCR 산물을 겔에 직접 로딩할 수 있게 합니다. 이 믹스는 두 가지 염료 성분이 혼합되어 있어 로딩 시 녹색을 띠며, 전기영동 과정에서 파란색과 주황색 성분으로 분리됩니다. 파란색 밴드는 1% 겔에서 3~4kb 크기의 단편과 함께 이동하는 반면, 주황색 밴드는 50bp 미만의 단편과 함께 이동합니다.

KAPA 마우스 유전자형 분석 키트는 일반적인 단기 사용(최대 1주일)을 위해 4°C에서 보관할 수 있습니다. 키트를 주의 깊게 취급하고 오염되지 않은 경우, 키트 구성품이 실온에서 단기간(최대 24시간) 동안 (의도치 않게) 방치되어도 문제가 발생하지 않을 것으로 예상됩니다. 실온 또는 4°C에서의 장기 보관은 권장하지 않습니다.

KAPA Express Extract로 생성된 DNA 추출물은 -20°C에서 보관하여 일정 기간 동안 여러 PCR에 사용할 수 있습니다. 소량으로 분할하여 보관하는 것도 권장됩니다. 장기 보관을 위해서는 DNA 추출물을 TE 완충액으로 1:10 희석하여 DNA가 완충된 환경에서 보관되도록 하는 것이 좋습니다. 다만, 후속 응용 분야 및 DNA 수율에 따라 희석 비율은 1:1에서 1:20 사이로 조정할 수 있습니다. EDTA에 민감한 후속 응용 분야의 경우 TE를 pH 8.0-8.5의 10 mM Tris-HCl로 대체할 수 있습니다.

예, KAPA2G Fast Genotyping Mix는 다양한 방법으로 추출한 생쥐 조직 DNA와 함께 사용할 수 있습니다. 유전자형 분석 PCR에 사용할 최적의 DNA 추출물 양은 템플릿을 다양한 농도로 희석하여 PCR을 수행함으로써 결정해야 합니다.

예, KAPA 마우스 유전자형 분석 키트로 생성된 PCR 산물은 야생형 Taq 중합효소로 생성된 PCR 산물과 동일한 특성을 가집니다. 표준 프로토콜을 사용하여 시퀀싱하거나 제한 효소로 소화할 수 있습니다. 산물은 3'-dA 꼬리 구조를 가지며 TA 클로닝에 사용하거나, 클로닝 전에 평단말 처리하거나 제한 효소로 소화할 수 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면 표준 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제하는 것이 권장됩니다.

예, 일반적으로 사용되는 마우스 조직에서 DNA를 추출하여 KAPA SYBR® FAST를 이용한 마우스 유전자형 분석 qPCR 검사의 템플릿으로 사용할 수 있습니다. KAPA Express Extract Enzyme의 열 비활성화 후 샘플을 1분간 원심분리하여 잔여물을 침전시키고, DNA가 포함된 상층액을 별도의 튜브로 옮겨야 합니다. 권장 반응 설정 및 사이클링 프로토콜은 다음과 같습니다:

20µL 반응당 KAPA SYBR FAST 반응 설정

• PCR 등급 물: 8.2 µL
• KAPA SYBR FAST 2X qPCR 마스터믹스: 10.0 µL (최종 1X)
• 포워드 프라이머 (10 µM): 0.4 µL (최종 200 nM)
• 리버스 프라이머 (10 µM): 0.4 µL (최종 200 nM)
• KAPA Express Extract DNA: 1.0 µL

KAPA SYBR FAST 사이클링 프로토콜

• 효소 활성화: 95 °C, 3분
• 변성: 95 °C 5초 (40회 반복)
• 결합/연장: 60 °C 30초 (40회 반복)
• 분리: 장비 지침에 따름