발사르탄 내 N-니트로사민 함량 측정

미국 FDA 가이드라인에 따른 의약품 품질 관리를 위한 GC-MS 분석법

2018년 7월, 의약품 규제 당국은 발사르탄 기반 제품에서 니트로사민 불순물(N-니트로소디메틸아민, NDMA, 그림 1)이 발생했다는 사실을 통보받았습니다.1 활성 제약 성분(API)인 발사르탄은 안지오텐신 II 수용체 차단제입니다. 이 약물은 ACE 억제제 치료에 내성이 있는 환자의 고혈압, 심부전 및 심장마비 치료에 사용됩니다.2 발사르탄은 테트라졸기(질소 4개와 탄소 1개로 구성된 고리)를 공통으로 갖는 사르탄 계열로 알려진 구조적으로 유사한 화합물 그룹에 속합니다. 이후 N-니트로소디에틸아민(NDEA), N-니트로소디이소프로필아민(NDIPA), N-니트로소에틸이소프로필아민(NEIPA), N-니트로소디부틸아민(NDBA) 등 다른 니트로사민 불순물이 사르탄 계열의 다른 의약품과 라니티딘 제제에서 발견되었습니다. 벌크 발사르탄 원료를 사용한 의약품에 대한 전 세계적 리콜 조치가 이어지면서 시장에는 발사르탄 기반 의약품의 일시적 공급 부족 현상이 발생했습니다.

N-니트로사민은 니트로소 기능기(-N=O)를 포함합니다. 세계보건기구(WHO) 산하 국제암연구소(IARC)에 따르면, 대부분의 니트로사민은 동물에게 발암성 및 유전독성을 가지며 인간에게도 발암 가능성이 있는 물질입니다. 당국과 원료의약품(API) 제조업체들은 제조 공정 중 산성 조건에서 2차 또는 3차 아민과 아질산염의 반응으로 니트로사민이 생성된다는 사실을 발견했습니다. 사르탄 계열 약물은 테트라졸 고리 형성을 위해 아질산나트륨이 필요하며, 이 과정에서 N-니트로사민이 생성될 수 있습니다. 또는 오염된 용매, 시약 또는 제조 장비로 인해 니트로사민이 첨가될 수도 있습니다.3 이에 따라 유럽약전(Ph. Eur.) 위원회는 원료의약품 내 니트로사민에 대해 1ppm 미만의 잠정 한도를 설정했으며, 2020년 말에는 이 한도가 30ppb로 강화되었습니다.4

이러한 한계치 측정을 위해서는 고감도 및 고선택성 분석 기법의 사용이 필수적이다. 대부분의 분석법은 GC-MS 또는 HPLC-MS를 활용한다.5-7 또한 다양한 니트로사민, 원료의약품(API), 제형으로 인해 불순물 검사를 위한 맞춤형 분석법 개발이 요구된다는 점이 또 다른 과제이다.

본 연구는 미국 FDA 지침에 따라, GC-MS/MS를 EI MRM 모드로 사용하여 발사르탄 의약품 내 5가지 니트로사민 불순물(NDMA, NDEA, NEIPA, NDIPA 및 NDBA)을 미량 수준에서 정량하는 절차를 제시한다. FDA 시험연구실(OTR)에서 발표한 방법 중 하나를 방법 개발의 기초로 사용했습니다.8 방법 검증은 USP 요구 사항에 따라 수행되었습니다.9

실험적

GC-MS/MS 방법은 액체 주입을 사용하여 광범위한 니트로사민을 포괄하였다. OTR 방법과 달리, 더 얇은 막 두께(1 µm 대신 0.5 µm)의 왁스 컬럼이 선택되었다. 그러나 이는 크로마토그래피에 관한 USP 일반 장 <621>을 준수한 것이다.10 크로마토그래피 조건과 MS/MS 조건은 표 1~3에 제시되어 있다.

5종의 니트로사민은 10분 미만에 충분히 분리되었으며, 목표 피크는 용매 및 매트릭스 피크로부터 잘 분해되었다(그림 2). 관찰된 유지 시간은 FDA OTR 방법에 비해 짧았으며, 이는 GC 컬럼의 얇은 막 두께에 기인한 것으로 추정된다.

다중 반응 모니터링(MRM)을 통해 두 가지 전이에서 낮은 검출 한계를 달성하였다. 그림 3에는 NDEA와 NDIPA의 크로마토그램을 통해 최저 농도 2.5 ppb에서 신호 대 잡음 비율이 10 이상인 두 가지 사례가 제시되어 있다.

방법 적합성

검증된 FDA-OTR 방법은 40 ng/mL 표준물질의 6회 반복 주입에 대한 % RSD가 ≤ 5%여야 합니다. 본 방법을 사용했을 때, 40 ng/mL 표준물질의 6회 연속 주입에 대한 % RSD는 표 4에 표시된 바와 같이 두 MRM 모두에서 모든 불순물에 대해 5% 미만이었습니다.

또한 선형 교정 곡선의 상관 계수(r²)는 ≥0.998이어야 합니다. 본 방법은 두 MRM 모두에서 다섯 가지 니트로사민 모두에 대해 이 기준을 초과했습니다(표 5).

발사르탄 의약품 적용

현지 약국에서 구입한 상업용 발사르탄 제품에 니트로사민 불순물을 첨가하여 의약품 내 농도를 10 ppb(NDBA의 경우 40 ppb)로 설정하였다. 니트로사민의 회수율을 측정한 결과 각각 94.5~105.7% 범위로 나타났다(표 6).

FDA-OTR 방법은 발사르탄 제품 내 니트로사민 검출을 위한 정량 한계(LOQ)가 8~40 ppb 범위에 있다고 보고했습니다. 본 방법은 발사르탄 의약품에서 더 낮은 LOQ를 달성했습니다(표 7). 각 화합물에 대해 신호/잡음비(S/N) 10을 기준으로 교정 곡선으로부터 LOQ를 계산하였으며, 발사르탄 정제에 대한 표준 첨가 실험을 통해 검증하였습니다. 검출한계(LOD)는 신호/잡음비(S/N) 3을 사용하여 계산하였습니다.

요약

FDA-OTR에서 제안한 방법을 기반으로SUPELCOWAX^® 컬럼을 사용하여 MRM 모드에서 GC-MS/MS를 통해 니트로사민 불순물 측정이 용이하게 수행될 수 있다. 모든 니트로사민은 서로 및 용매 및 매트릭스 피크로부터 잘 분리되어 시스템 적합성 요건을 충족하였다. 본 방법은 니트로사민 불순물이 첨가된 발사르탄 의약품 분석에 성공적으로 적용되었다.

재료