サンガー法による塩基配列決定の手順と方法
8月12日のテスト
図1。自動サンガーシーケンシングの3つの基本手順。
サンガー法によるシーケンシングの手順
サンガー法によるシーケンシングには、主に3つの手順があります。
1. 鎖終止PCR用のDNA配列
対象となるDNA配列を、鎖終止PCRと呼ばれる特殊なPCRのテンプレートとして使用します。鎖終止PCRは標準的なPCRとほぼ同じ仕組みですが、1つの大きな違いがあります。それは、ジデオキシリボヌクレオチド（ddNTP）と呼ばれる修飾ヌクレオチド（dNTP）が添加される点です。 標準的なPCRの伸長段階では、DNAポリメラーゼが、最後のヌクレオチドの遊離した3'-OH基と次のヌクレオチドの5'-リン酸基との間にホスホジエステル結合の形成を触媒することで、伸長中のDNA鎖にdNTPを付加します（図2）。
鎖終止PCRでは、PCR反応において、通常のdNTPに少量の鎖終止性ddNTPを混合します。ddNTPには、ホスホジエステル結合の形成に必要な3'-OH基が欠けています。そのため、DNAポリメラーゼがddNTPをランダムに取り込むと、伸長が停止します。 鎖終止PCRの結果、目的のDNA配列のオリゴヌクレオチドが数百万から数十億コピー生成され、5'-ddNTPによってランダムな長さ（n）で鎖が終止されます。
手動によるサンガーシーケンシングでは、4つのPCR反応が設定され、それぞれに1種類のddNTP（ddATP、ddTTP、ddGTP、およびddCTP）のみが混合される。
自動サンガーシーケンシングでは、すべての ddNTP が 1 つの反応に混合され、4 種類の dNTP にはそれぞれ固有の蛍光標識が付いています。
2. ゲル電気泳動によるサイズ分離
第2段階では、鎖終止されたオリゴヌクレオチドをゲル電気泳動によりサイズ別に分離します。ゲル電気泳動では、DNAサンプルをゲルマトリックスの片端にロードし、電流を流します。DNAは負に帯電しているため、オリゴヌクレオチドはゲルの反対側にある正極に向かって引き寄せられます。 すべてのDNA断片は質量単位あたりの電荷が同じであるため、オリゴヌクレオチドの移動速度はサイズのみによって決まります。断片が小さければ小さいほど、ゲル内を移動する際の摩擦が少なくなり、移動速度は速くなります。その結果、ゲルを下から上に向かって読み取ると、オリゴヌクレオチドは小さいものから大きいものの順に配列されます。
手動によるサンガーシーケンシングでは、4つのPCR反応それぞれから得られたオリゴヌクレオチドを、ゲルの4つの別々のレーンで走査します。これにより、どのオリゴヌクレオチドがどのddNTPに対応しているかを特定することができます。
自動サンガーシーケンシングでは、すべてのオリゴヌクレオチドがシーケンサー内の単一のキャピラリーゲル電気泳動で走査されます。
3. ゲル解析およびDNA配列の決定
最後のステップは、ゲルを読み取って入力DNAの配列を決定するだけです。 DNAポリメラーゼは、提供されたプライマーを起点として5’から3’の方向にのみDNAを合成するため、各末端のddNTPは元の配列内の特定のヌクレオチドに対応することになります（例えば、最も短い断片は5’末端から1番目のヌクレオチドで終了し、2番目に短い断片は5’末端から2番目のヌクレオチドで終了するなど）。 したがって、ゲル上のバンドを小さいものから大きいものの順に読み取ることで、元のDNA鎖の5’→3’方向の配列を決定することができます。
手動によるサンガーシーケンシングでは、ユーザーはゲルの 4 本のレーンすべてを一度に、下から上へと読み取り、各バンドの末端 ddNTP を特定します。 たとえば、一番下のバンドが ddGTP に対応する列に見つかった場合、最小の PCR 断片は ddGTP で終了しており、元の配列の 5’ 末端から 1 番目のヌクレオチドはグアニン (G) 塩基であることがわかります。
自動サンガーシーケンシングでは、コンピュータがキャピラリーゲルの各バンドを順番に読み取り、蛍光を利用して各末端 ddNTP の種類を判定します。 つまり、レーザーが各バンド内の蛍光タグを励起し、コンピュータがそれによって放出される光を検出します。4種類のddNTPにはそれぞれ異なる蛍光ラベルが付与されているため、放出される光は末端のddNTPの種類と直接結びつけることができます。この出力結果はクロマトグラムと呼ばれ、テンプレートDNAの長さに沿って各ヌクレオチドの蛍光ピークを示します。
図2。DNAの構造図。DNAは、2本の鎖が互いに巻きついて二重らせんを形成する分子です。各鎖は、デオキシリボヌクレオチド（dNTP）と呼ばれる分子の連なりから構成されています。
各dNTPは、リン酸基、糖基、および4種類の窒素含有塩基（アデニン（A）、チミン（T）、グアニン（G）、シトシン（C））のうちの1つを含んでいます。 dNTPは、あるdNTPの糖と次のdNTPのリン酸基との間のホスホジエステル共有結合によって直線状に連なっており、この繰り返される糖-リン酸のパターンが糖-リン酸骨格を構成しています。
2本の別々の鎖の窒素塩基は、相補的な塩基間の水素結合によって結合し、二本鎖DNAらせんを形成します。
サンガーシーケンシングの結果の読み方
サンガーシーケンシングの結果を正しく読み取るには、2本の相補的なDNA鎖のうちどちらが対象となるか、およびどのプライマーが利用可能かによって異なります。 DNAの2本の鎖をAとBとし、鎖Aが対象であるものの、プライマーが鎖Bに適している場合、出力される断片は鎖Aと同一になります。一方、鎖Aが対象であり、かつプライマーが鎖Aに適している場合は、出力は鎖Bと同一になります。したがって、出力結果を鎖Aに換算し直す必要があります。
したがって、対象となる配列が「TACG」で、そのプライマーが対象鎖に最適である場合、出力は「ATGC」となるため、これを「TACG」に元に戻す必要があります。しかし、プライマーが相補鎖（「ATGC」）に最適である場合、出力は「TACG」となり、これが正しい配列となります。
要するに、開始する前に、何をターゲットとしているのか、そしてどのようにしてそこに到達するのかを知っておく必要があります！ この点を念頭に置いて、前述の例（TACG → ATGC → TACG）の具体例を示します。ジデオキシヌクレオチドのラベルを T = 黄色、A = ピンク、C = 紺色、G = 水色とした場合、最終的に「プライマー-A」、「プライマー-AT」、「プライマー-ATG」、「プライマー-ATGC」という短い配列が得られます。 断片が電気泳動によって分離されると、レーザーが長さの順（ピンク、黄色、水色、紺色）に断片を読み取り、クロマトグラムを生成します。コンピュータが文字に変換するため、最終的な配列は正しい「TACG」となります。
サンガー法とPCRの比較
サンガーシーケンシングとPCRは、同様の出発物質を使用し、互いに併用することも可能ですが、どちらも他方を置き換えることはできません。
PCRは、DNA全体を増幅するために用いられます。長さの異なる断片が偶然生成される場合もありますが（例えば、DNAポリメラーゼが離脱するなど）、その目的はDNA配列全体を複製することにあります。そのために必要な「材料」は、標的DNA、ヌクレオチド、DNAプライマー、およびDNAポリメラーゼ（具体的には、PCRに必要な高温に耐えられるTaqポリメラーゼ）です。
対照的に、サンガーシーケンシングの目的は、標的DNAの全長に至るまで、あらゆる長さのDNAを生成することです。そのため、PCRの開始材料に加えて、ジデオキシヌクレオチドが必要となります。
サンガーシーケンシングのプロトコルに必要な出発物質を生成する際、サンガーシーケンシングとPCRを組み合わせることができます。PCRを用いることで、シーケンシング対象となるDNAのコピーを多数作成することが可能です。
使用するテンプレートが複数あることで、サンガー法のプロトコルの効率が向上します。標的配列の長さが1,000ヌクレオチドで、テンプレートが1コピーしかない場合、1,000個のタグ付き断片を生成するにはより長い時間がかかります。しかし、テンプレートが複数コピーある場合、理論上は1,000個すべてのタグ付き断片を生成するのに要する時間は短くなります。