チオール修飾オリゴ（SH修飾オリゴ）ヌクレオチドのDDT還元プロトコル

ジスルフィド結合の還元

このプロトコルは、チオール修飾オリゴヌクレオチドのジスルフィド結合を還元し、 sulfhydryl基にするためのものです（図1）。sulfhydryl基は、オリゴヌクレオチドを金ナノ粒子などの固体表面に付着させるのに使用できます。Cleland試薬とも呼ばれる ジチオスレイトール（DTT）を用いたジスルフィド結合の還元によって、使用が可能になります。

消耗品

• ・2mL遠心チューブ
• ・ピペットチップ
• ・Milli-Q^®H₂O
• ・DTT （D9779）
• ・NAP™-10カラム（GE17-0854-01）
• ・リン酸ナトリウム緩衝液
• ・チオール修飾オリゴヌクレオチド

方法

還元方法は、以下の2つの主要ステップに分かれています。1）sulfhydryl基形成、2）副生成物の除去

sulfhydryl基形成

1. 1.　DTTを100mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH8.3～8.5）に溶解させて100mM溶液を調製します。この緩衝液5mLに対してDTT77.13mgを溶解させてください。
2. 2.　12.5OD（光学密度単位）まで、DTT溶液125µLにチオール修飾オリゴヌクレオチドを溶解させます（12.5ODを超える場合は、DTT溶液とオリゴヌクレオチドODを10：1の割合で維持してください）。
3. 3.　室温で1時間インキュベートします。

副生成物の除去

1. 1.　NAP-10カラムを100mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）約15mLで平衡化させます。平衡化緩衝液がゲルベッドに完全に浸透するようにしてください。
2. 2.　反応混合物1.0mLをNAP-10カラムに添加します（必要に応じて、リン酸ナトリウム緩衝液［pH6.0］で反応混合物の液量を1.0mLにしてください）。反応混合物がゲルベッドに完全に浸透するようにしてください。
3. 3.　リン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）1.0mLでチオール修飾オリゴヌクレオチドを遠心チューブ内に溶出させます。

補足

リン酸ナトリウム緩衝液は（pH8.3～8.5とpH6.0のいずれも）、実験室の標準的手法に従って調製してください。バッファーはすべてMilli-Q^®水で調製してください。