細胞培養における汚染のトラブルシューティング
8月12日のテスト
培養汚染：概要
「細胞培養の汚染」と聞くと、通常は細胞の間に細菌が混入したり培地が濁ったりする様子を連想しがちですが、培養フラスコに侵入する望ましくない異物は、さまざまな形態をとることがあります。ウイルスや化学物質による汚染も、培養状態に対して重大な影響を及ぼす可能性があり、細胞株が交差汚染されないようにすることは、結果の再現性を確保する上で極めて重要です。
細胞汚染はどれほど広範に及んでいるのでしょうか？FDAやATCCなどの研究によると、現在、すべての細胞培養のうち5～30％がマイコプラズマ属だけで汚染されていると推定されています。ある研究5では、一般的な細胞株におけるウイルス汚染の発生率は25％を超え、非細胞病原性ウイルスは、培養状態からはその存在の手がかりが得られないため、マイコプラズマよりも検出を逃れやすい傾向があります。
図1。細胞の混入
特定の汚染物質を制御するための鍵は、その検出のしやすさに関係している場合があります。 細菌、真菌、酵母などの汚染物質は、多くの場合、肉眼でも確認でき、培養中の細胞を急速に死滅させることもありますが、マイコプラズマのような重要な微生物侵入者は、その形態が微妙であるため、同定が困難になる場合があります。これに対し、ウイルスは従来の光学顕微鏡ではまったく検出できないため、原因不明の細胞剥離や、細胞の健康状態の悪化、さらには細胞死を示すその他の兆候が観察されたことをきっかけに、その存在が判明することがよくあります。
近年、生物学界が直面している最も重大な懸念の一つは、研究用細胞株の汚染、あるいは完全な誤同定です。この重要なトピックについてさらに詳しく知りたい方は、こちらをクリックして、交差汚染された細胞株の原因と発生頻度、および細胞株の同一性の完全性を評価する方法についてご確認ください。
細菌、真菌（カビを含む）、および酵母による汚染は、通常、培養培地の急速な濁りや変色として肉眼で確認できます（ただし、培地に最も一般的な無毒のpH指示薬であるフェノールレッドが添加されている場合に限ります）。 標準的な光学顕微鏡検査でも細菌細胞や真菌の構造を確認できるため、培養物を毎日顕微鏡で観察することで、微生物汚染を早期に発見し、最初の兆候が現れた時点で直ちに適切な措置を講じることが可能になります。 特に、隣接する培養物や、培養インキュベーター、水浴槽、バイオセーフティキャビネットなどの無菌組織培養環境を保護するためには、汚染された培養物を速やかに除去する必要があります。さらに、細菌や真菌に対する特定の検査を、日常的かつ定期的な品質管理スクリーニング手順の一環として実施すべきです。
微生物汚染の一般的な原因と予防策
マイコプラズマは、細胞壁を持たない細菌の一属であり、そのため、細胞壁の形成を阻害することで細菌の増殖を抑制する抗生物質の影響を受けません。その柔軟な形態と0.15～0.3 µmの範囲にある細胞サイズのため、0.22 µmの孔径を持つフィルターをしばしば使用する標準的な細胞培養のろ過法では捕捉できない可能性があります。 他のほとんどの細菌汚染物質とは異なり、マイコプラズマは目視検査では確認できず、その形態や極めて小さなサイズのため、光学顕微鏡による検出も困難である。 培養中のマイコプラズマの濃度（力価）は、培地の濁りを引き起こすことなく10⁸個体/mLに達することがあります。通常、感染した哺乳類細胞を死滅させることはありませんが、細胞代謝を変化させ、染色体異常を引き起こし、細胞増殖を遅らせ、細胞の付着を妨げることで、培養に重大な影響を及ぼします。要するに、感染した細胞株を用いて行われるほとんどの実験結果に、劇的な影響を与える可能性が高いのです。
図2。DAPIやHoechstなどの一般的なDNA検出試薬を用いると、蛍光顕微鏡下で汚染された培養物（右）中のマイコプラズマの存在を確認することができる。
実験室におけるマイコプラズマ汚染の原因は多岐にわたり、その対処は困難を伴う場合があります。特定のマイコプラズマ種はヒトの皮膚にも存在するため、胎児牛血清などの汚染された培地成分を介して持ち込まれるほか、不適切な無菌操作によって持ち込まれる可能性もあります。 マイコプラズマは、近接する汚染された細胞培養間でも非常に伝播しやすい。マイコプラズマの処理には、孔径0.1 µm以下の膜を用いた培地および緩衝液のろ過が必要である。これは、孔径0.22 µmまたは0.45 µmの標準的な培地ろ過装置では、これらの微小な微生物を除去できないためである。
マイコプラズマ汚染の予防、検出、および除去
マイコプラズマが培養物に一度混入すると、実験室の他のエリアへ急速に拡散する可能性があります。適切な実験室管理基準（GLP）を厳格に遵守することが重要であり、マイコプラズマ汚染を効果的に制御するためには、定期的なマイコプラズマ検査を強く推奨します。 検出に最も一般的に用いられる3つの方法には、マイコプラズマ培養法、DNA染色法、およびPCRに基づく検出法があります。当社は、マイコプラズマの検出および除去のためのさまざまなソリューションを提供しています。実験室内でこの汚染物質の存在が疑われない場合でも、培養物のマイコプラズマスクリーニングをルーチン化することが極めて重要です。
微生物汚染の防止：抗生物質は解決策となるか？ 組織培養における問題の一つは、抗生物質を単独で、あるいは抗真菌薬と組み合わせて日常的に使用していることです。医師が処方する治療用抗生物質と同様に、抗生物質の継続的または不適切な使用は、根絶が困難な耐性株の出現につながり、細胞培養に毒性を及ぼす可能性のある次世代の抗生物質の使用を余儀なくされる恐れがあります。最近の研究では、抗生物質の存在下で培養細胞の遺伝子発現が変化する可能性について、さらなる懸念が提起されています。 |
ウイルスによる汚染
ウイルスは、細胞培養において検出が最も困難な汚染物質の一つであり、その検出には、ほとんどの研究機関では実用的な手段とは言えない顕微鏡検査法が必要となる。ウイルスは患者や宿主動物の細胞源に由来する場合があり、バイオテクノロジー上重要ないくつかの細胞株には内因性レトロウイルスが含まれていることが示されている。より一般的なのは、培養に用いられる動物由来の材料中に存在するウイルスによって細胞が感染する場合である。 ウイルスはサイズが小さいため、培地、血清、その他の生物由来の溶液から除去することが非常に困難である。しかし、ほとんどのウイルスは宿主や組織に限定して感染するため、種間や組織間の感染能力は制限される可能性がある。ウイルスは多くの研究者が認識している以上に細胞培養において一般的である可能性があるが、細胞に細胞病変やその他の悪影響を及ぼさない限り、細胞培養にとって重大な交絡因子となるかどうかは定かではない。
培養細胞に影響を与える可能性に加え、ウイルスに感染した細胞培養物を使用する際の主要な懸念事項は、実験室スタッフに対する潜在的な健康リスクである。 ヒトやその他の霊長類由来の組織や細胞を扱う際は、細胞培養から実験室職員へのウイルス感染（HIV、B型肝炎、エプスタイン・バーウイルス、サルヘルペスBウイルスなど）の伝播を防ぐため、常に特別な安全対策を講じる必要があります。潜在的に危険な組織、培養物、またはウイルスを扱う手順については、所属機関の環境安全担当者に相談してください。細胞培養を扱う実験室職員のリスク評価に関する詳細はこちらをクリックしてください
細胞培養におけるウイルス汚染の発生率を低減するためのベストプラクティス：
*細胞を採取する生物学的供給源（供給業者、動物）の数を制限する。
*ウイルスに感染しにくい動物／細胞を選択する。
*ウイルス検査を実施し、ウイルスフリーの細胞株であることの証明書を発行するリポジトリから細胞を調達する。
化学的汚染
細胞培養における非生物由来の汚染物質は、多くの場合「化学的」汚染物質に分類されます。これらの汚染物質は、培地や緩衝液に使用される試薬や水、あるいは機器や消耗品に由来する可能性があります。例としては、フリーラジカル、金属イオン、消毒剤・洗剤の残留物、さらには上流工程の細菌汚染が除去された後も残留するエンドトキシンなどが挙げられます。
化学的汚染を防止するためのヒント：
*緩衝液や溶液の調製、および凍結乾燥試薬の再懸濁には、常に実験室用純水を使用すること。
*再利用可能な実験器具は、徹底的に洗浄し、自然乾燥させること。オートクレーブ処理では、洗剤の残留物を取り除くことはできない。
*培地、補足剤、および血清（FBS、FCS）は、エンドトキシン試験の証明書を提供するサプライヤーからのみ調達すること。
汚染の防止および除去に関する一般的なヒントと手法
生物安全キャビネット内での作業
バイオセーフティキャビネット内で作業を行う際は、無菌環境を維持する上で空気の流れが極めて重要であることを念頭に置いておくことが役立ちます。効果的な空気の流れを確保するため、背面および前面の通気口は常に塞がないようにしてください。実際の手順を開始する前に、操作者の袖や手から汚染物質が移る可能性を最小限に抑えるため、キャビネット内に必要な資材をすべて用意しておく必要があります。
気流が安定してから少なくとも20分経過してから、使用する物品をキャビネット内に配置してください。キャビネット内に持ち込むすべての物品は、ほこりや微粒子がキャビネット内に侵入するのを防ぐため、まず70％（v/v）の滅菌用アルコールでスプレーし、糸くずの出ないワイプで拭き取らなければなりません。蓋や容器を開ける前には、気流が十分に安定していることを確認し、気流によって作業領域に混入した可能性のある微粒子が除去されるようにしてください。
図3。安全キャビネット内での作業
ピペッティングとエアロゾルの防止
1～100 mLの容量が用意されている使い捨てプラスチックピペット（血清用ピペットとも呼ばれる）は、細胞培養に欠かせない道具です。これらは無菌性を確保するため、個別に包装されている必要があります。以下の指針を順守することで、ピペッティングに伴う汚染や安全上のリスクを最小限に抑えることができます。
- 自動ピペッティング装置を使用し、各装置は1つのキャビネット内でのみ使用するように制限してください。汚染を防ぐため、ピペッティング装置の部品は定期的に分解・消毒してください。ピペッティング装置のフィルターは十分に備蓄し、定期的に交換するようにしてください。
- 可能な限り、特に培地を移す際は、上部を綿で塞いだピペットを使用してください。ピペットの栓に液体が吸い込まれないように注意してください。万が一、栓が濡れてしまった場合は、直ちにピペットアシストのフィルターを交換してください。
- 血清用ピペットには一切触れないようにするため、包装を部分的に開け、先端をピペッティング補助器具に装着してから、紙のスリーブを取り外してください。
- 汚染の原因となるエアロゾルの発生を防ぐため、培地やピペット内に気泡を作らないでください。
消毒
培養廃棄物、作業面、および機器の消毒・除染を目的とした方法は、汚染リスクを最小限に抑えるだけでなく、実験室スタッフにとって安全でなければなりません。濃縮型の消毒剤を使用する際は、常に手袋や保護メガネなどの適切な個人用保護具（PPE）を着用してください。選択する手袋は、取り扱う物質から手を保護できるものでなければなりません。メーカーのチャートは、特定の作業に最適な手袋を特定するのに役立ちます。 主な消毒剤はいくつかのグループに分類され、それぞれの相対的な利点は次のように要約できます：
次亜塩素酸ナトリウム（漂白剤）
- 優れた汎用消毒剤
- ウイルスに対して有効
- 金属に対して腐食性がある――遠心分離機などの金属表面には使用すべきではない
- 有機物によって容易に不活化されるため、頻繁に新しい溶液を調製する必要がある
- 市販の漂白剤を用いて、廃液中の10％（v/v）溶液を作成するか、表面消毒に使用する
アルコール（例：エタノール、イソプロパノール）
- 有効濃度：エタノールは70％、イソプロパノールは60～70％
- 細菌に対して有効。エタノールはほとんどのウイルスに対して有効であるが、非エンベロープウイルスには効果がない
- イソプロパノールはウイルスに対して効果がない
- アルデヒド類は刺激性があるため、使用を制限すべきである
フェノール系消毒剤は、EUの殺生物剤指令の見直しプログラムにおいて推奨されていないため、使用を避けるべきである。
健常細胞の定期的なモニタリングの実施方法
細胞培養のモニタリングは、日々の細胞培養において重要な作業です。このチュートリアルでは、健全な培養状態の特徴、細胞のコンフルエンシー、細胞培養の増殖段階など、細胞のモニタリングに関する基本について解説します。また、この動画では、細菌やマイコプラズマによる汚染の一般的な兆候についても紹介します。