AAW™ 자동화 분석 워크스테이션에서 SMC^® 면역분석법 자동화 방법

본 프로토콜은 AAW™ 자동화 분석 워크스테이션을 사용하여 SMC^® 초고감도 면역분석법을 자동화하는 방법을 상세히 설명합니다. 자동화는 분석의 견고성과 재현성을 보장하면서 작업 시간을 단축합니다. 자세한 내용과 데이터는 아래를 참조하십시오.

자동화 및 ^{Sigma-Aldrich®} 재료 필요

시약

SMC^® 분석법을 선택하십시오. AAW™ 자동화 분석 워크스테이션에서 검증된 SMC^® 분석법의 예시에는 다음이 포함됩니다:

시료 전처리 실험 용기

하드웨어 및 계측기

위 사항 외에도 본 프로토콜은 Opentrons Flex™ 히터-셰이커를 사용합니다 — 견적 요청하기.

실험실 용기

• 96-웰 V-바텀 플레이트 (제품 번호 AXYP96450VCS)
• SMC^® 384-웰 상용 플레이트 (키트 프로토콜 참조)
• NEST 12-웰 15mL 저장소 (Opentrons^® 제품 번호 99900076)
• NEST 2mL 96-웰 플레이트 (Opentrons^® 제품 번호 99900103)
• 구형 자석 플레이트 (제품 번호 90-0003-02, BioTek^® 405™TSUVS 플레이트 세척기와 함께 제공)
• Opentrons^® 50 μL 팁 랙, 여과형 (제품 번호 99100104)
• Opentrons^® 1,000 μL 팁 랙, 여과형 (제품 번호 99100106)
• 알루미늄 접착 플레이트 씰 (Fisher Sci 제품 번호 276014)
• 5 mL Luer-Lok™ 주사기 (Fisher Sci 제품 번호 14-829-45)
• 0.2 μm 주사기 필터 (제품 번호 SLGPR33RS)

SMC^® 분석을 위한 AAW™ 워크스테이션 준비

AAW™ 워크스테이션은 SMC^® 면역분석을 자동화하는 데 사용되었습니다. 분석 프로토콜은 Python 코드로 변환되어 Opentrons^® 앱 및 워크스테이션으로 가져왔습니다. 이 장비는 연속 곡선 희석, 온-덱 교반, 자기 비드 풀다운을 포함한 모든 액체 처리 단계를 수행했습니다. 플레이트 세척은 BioTek^® 405™TSUVS Plate Washer for SMC^® and MILLIPLEX^® Technology(제품 번호 95-0004-06)를 사용하여 장비 외부에서 수행됩니다. SMC^® 분석 수행을 위해 장비를 준비하려면:

1. Millipore^® 프로토콜 라이브러리에서 SMC^® 키트 프로토콜 파일을 다운로드하여 컴퓨터의 Opentrons^® 앱에 로드합니다. 이후 "Send to Opentrons FLEX" 또는 "Start Set-up" 기능을 통해 프로토콜을 AAW™ 로봇으로 전송할 수 있습니다.
2. 앱 또는 AAW™ 터치스크린에 표시된 대로 필요한 모듈과 피펫을 장착하십시오. Opentrons FLEX™ 히터-셰이커를 데크 슬롯 D3에 장착하십시오. 모듈이 연결되고 전원이 켜졌으며 앱 또는 터치스크린 모듈에 표시되는지 확인하십시오.
3. 프로토콜이 로봇으로 전송되면 프로토콜을 선택하고 "설정 시작" 버튼을 눌러 분석을 시작할 수 있습니다. 아래와 같이 특정 분석 설정을 선택할 수 있는 매개변수 목록이 표시됩니다:
   1. 다중 채널 마운트: 왼쪽(기본값) 또는 오른쪽
   2. 검출 항체: 관심 있는 SMC^® 분석 키트 (16가지 옵션)
   3. 실행 유형: 표준 곡선 + 샘플 실행(기본값) 또는 표준 곡선만 실행
   4. 드라이 런: 연습용으로 사용 시 인큐베이션 및 세척 단계를 단축하여 실행 (기본값: 켬)
   5. 캡처 단계 전 플레이트 밀봉: 캡처 단계 전 수동으로 플레이트를 밀봉할지 여부를 선택합니다. 켜기 또는 끄기(기본값). 플레이트 설정 후 즉시 캡처 단계로 진행됩니다.
   6. 샘플 희석: 켜기 또는 끄기 (순수 샘플의 경우 기본값은 끔)
   7. 희석 비율: 샘플 + 희석 샘플 선택 시 2 입력
      (기본값) 참고: 다른 샘플 희석 비율(1:3~1:1,000)이 필요한 경우, SMC^® 프로토콜 실행 전에 SMC^® 샘플 희석 프로토콜을 실행하십시오.
   8. 샘플 수: 1-20개 입력
4. AAW™ 워크스테이션에서 분석 단계를 숙지하기 위해 프로토콜의 드라이 런 실행을 권장합니다. 드라이 런은 액체 없이 또는 물/완충액으로 실행할 수 있습니다. 드라이 런은 혼합 및 배양 단계를 단축하고, 추가 연습을 위한 팁을 랙으로 반환하는 기능을 포함합니다. 
5. 실행 시작 전, 터치스크린 또는 Opentrons^® 앱의 단계별 지침에 따라 실험용기 위치 확인을 최소 한 번 수행해야 합니다. 실험용기 오프셋이 확인되면 AAW™ 워크스테이션은 향후 실행을 위해 해당 값을 저장하며, 원하는 경우를 제외하고는 반복할 필요가 없습니다. 실험용기 위치 확인은 드라이 런 중 빈 실험용기로 또는 시약이 준비된 실험용기로 실행할 수 있습니다.

SMC^® 고감도 키트 설정 절차

 SMC^® 면역분석은 제품 설명서에 따라 수동으로 또는 AAW™ 워크스테이션의 수정된 프로토콜을 사용하여 수행되었습니다(아래 참조). 본 적용 연구에서는 SMC^® 분석을 AAW™ 워크스테이션에서 3회 반복했습니다. BioTek^® 플레이트 세척기에서 수행된 세척 단계를 제외한 모든 분석 단계는 기기 데크에서 수행되었습니다. 모든 분석은 SMCxPRO^® 기기에서 판독되었으며, 데이터는 xPRO^® 소프트웨어를 통해 수집되었습니다. 필요한 실험 용기 및 재료의 제품 목록은 상단에서 확인할 수 있습니다.

시약 준비

참고: 시약은 각 SMC^® 키트별 설명서에 따라 준비되었습니다.

1. 사용 전 모든 시약을 실온(RT)으로 따뜻하게 합니다.
2. 포스트 캡처 세척 후 사용 준비가 될 때까지 검출 항체는 빛을 피해 보관하십시오. 검출 항체를 희석할 시기는 터치스크린 지시에 따라 진행하십시오.
3. 1X 세척 완충액(10X 세척 완충액에서 준비)을 준비하십시오.
4. 로티세리 스핀 로테이터를 사용하거나 반복적인 피펫팅을 통해 항체 코팅 비드를 혼합하십시오.
5. 표준+샘플 및 시약 저장소 플레이트에 예시 그림 1 또는 AAW™ 워크스테이션 터치스크린에 표시된 대로 시약을 로드하십시오.
   1. 정확한 용량은 프로토콜 시작 시 Opentrons^® 앱 또는 AAW^™ 터치스크린에서 확인할 수 있습니다.
   2. 이 프로토콜에서 1:2 희석 비율로 희석된 시료를 실행하는 경우에만 시료 희석제가 필요합니다. 그렇지 않은 경우, 본 분석 전에 SMC^® 시료 희석 프로토콜을 실행하십시오. 시료 희석 시약 위치는 이 자동화 SMC^® 프로토콜과 호환됩니다.

참고: 표준 프로토콜만 실행하는 경우, 아래 팁과 요령 섹션에서 용량을 확인할 수 있습니다.

샘플 준비

다음 방법 중 하나로 시료를 준비하십시오: 1) 사용 직전에 시료를 13,000 x g 이상으로 10분간 원심분리하거나 2) 프리필터가 장착된 필터 플레이트를 사용하는 경우: 필터 플레이트를 96-웰 V-바텀 리셉터클 플레이트 위에 쌓습니다. 필터 플레이트 웰에 400µL의 시료를 넣고 1,100 x g에서 10분 이상 원심 분리합니다. 시료를 원액 또는 1:2로 희석하여 사용하면 그림 1과 같이 시약 플레이트에 로드할 수 있습니다. 다른 시료 희석이 필요한 경우, SMC^® 시료 희석 프로토콜을 사용하거나 SMC^® 분석 실행 전에 시료를 수동으로 희석하십시오. 시료 희석 프로토콜은 Millipore^® 프로토콜 라이브러리 페이지에서 확인하실 수 있습니다.

로봇 데크 구성 및 분석 프로토콜

모든 시약과 샘플을 준비하여 적절한 웰에 첨가한 후, AAW™ 워크스테이션에서 덱 레이아웃을 설정할 수 있습니다. 덱 레이아웃은 그림 2에 표시되어 있습니다.

1. 데크 스팟 A1과 B1에 50µL 팁 2박스를 로드하십시오.
2. 1,000µL 팁 1박스를 덱 스팟 A2에 로드하십시오.
3. NEST 12-트러프 리저버를 B2에 장착하십시오.
4. C2에 자기 플레이트를 로드하십시오.
5. D1에 SMCxPRO^® 384-웰 판독 플레이트(스커트형 뚜껑 제외)를 장착하십시오.
6. D2에 NEST 2mL 96-웰 시약 플레이트를 로드하십시오.
7. 히터-셰이커(D3)에 96-웰 V-바텀 분석 플레이트를 장착하십시오.

1. 모든 실험 용기와 시약이 제자리에 배치되면 로봇 도어를 닫을 수 있습니다. 설정 시작 기능이 이미 활성화되고 매개변수가 선택된 경우, 파란색 실행 화살표를 선택하여 분석을 시작할 수 있습니다. 분석 워크플로는 그림 3에 요약되어 있습니다.

2. 검출 단계에서는, 플레이트 세척 중 키트 지침에 따라 검출 항체를 준비하고 희석된 검출 항체 용액을 NEST 12-트러프 저장소의 웰 5로 옮깁니다.
3. AAW^™ 워크스테이션 터치스크린의 안내에 따라 검출 및 용출/이송 단계를 계속 진행하십시오. 온-덱 검출 및 용출 배양 단계 전에 플레이트를 수동으로 알루미늄 밀봉재로 밀봉할 수 있도록 일시 정지 시간이 내장되어 있습니다. 배양 단계 후 복귀 시점은 터치스크린에 표시된 타이밍을 따르십시오.
4. 프로토콜 완료 후, 플레이트 홀더(스커트형 뚜껑)를 플레이트 하단에 장착하고 플레이트 롤러를 사용하여 알루미늄 접착식 플레이트 씰로 판독용 플레이트를 단단히 밀봉하십시오. 실온(RT)에서 약 1,100 x g로 1분간 플레이트를 원심분리하십시오.
5. 밀봉된 판 판독기에서 판 홀더를 제거하고 SMCxPRO^® 면역분석 시스템에 장착하십시오. 판 판독을 시작하십시오.

자동화 SMC^® 분석법 대 수동 분석법 결과

AAW™ 워크스테이션에서 자동화된 SMC^® 프로토콜은 IL-6, cTnI, IL-17A, IL-22, IL-23 및 IL-17F를 포함한 6가지 서로 다른 SMC^® 키트에서 검증되었습니다. 워크스테이션에서 분석을 3회 반복 실행하고 수동 성능과 비교했습니다. AAW™ 기기에서 수행된 각 실행에서, 각 IL-6 분석은 발표된 수동 LLOQ인 0.077 pg/mL보다 낮은 정량 하한(LLOQ)을 보였으며, 평균 2개의 이상값이 제거되었습니다(그림 4). cTnI는 세 번의 실행 중 두 번이 발표된 LLOQ인 0.694 pg/mL와 일치하는 LLOQ 결과를 달성했습니다(그림 4). 한 번의 실행은 이 기준을 약간 초과했으나, 이는 수동 분석법 LLOQ(1.39 pg/mL)와 동일한 수준이었습니다. IL-17A 검사의 경우, 모든 자동화 성능이 발표된 LLOQ인 0.069 pg/mL보다 낮았으며(그림 4), 검사당 평균 1개가 조금 넘는 이상값이 제거되었습니다. 모든 자동화 검사는 수동 검사보다 제거된 이상값 수가 적었습니다. 전반적으로 이러한 결과는 자동화 검사가 모든 테스트 매개변수에서 신뢰성 있고 일관되게 수행되었음을 나타내며, 결과는 표 1에 요약되어 있습니다.

마찬가지로, IL-22, IL-23 및 IL-17F 검사는 각각 자동화 검사 실행 시 발표된 LLOQ(최저검출한계) 이상을 달성했습니다(그림 5). 각 분석법의 평균 이상치 수는 각각 0, 약 1, 약 3개로, 실행당 2, 3, 6개의 이상치가 제거된 수동 분석법보다 높았습니다. 이러한 결과는 표 1에도 요약되어 있습니다. 이 분석법들은 AAW^™ 자동화가 높은 분석 성능과 견고성을 유지하면서도 재현성과 일관성을 개선했음을 확인시켜 줍니다.  

개선된 분석 재현성은 수동(n=5) 및 자동화(n=4) 분석법으로 달성된 IL-6 LLOQ 비교에서 더욱 두드러지게 나타납니다(그림 6). AAW™ 워크스테이션을 사용한 표준 편차는 수동 분석법에 비해 통계적으로 유의미하게 감소했습니다(p<0.05). 마지막으로, 건강한 혈청 및 혈장 샘플을 대상으로 IL-6 SMC^® 키트를 사용한 수동 및 자동 분석 성능을 비교하였다(그림 7). 샘플 상관관계 결과는 AAW^™ 워크스테이션이 R² 값 0.9915로 수동 분석과 동등한 성능을 보임을 확인시켜 준다.

동일한 SMC^® 검사에 대한 서로 다른 워크스테이션 간 성능 비교를 통해 자동화 프로토콜의 견고성이 입증되었습니다. AAW™ 워크스테이션 1과 2에서의 성능 결과 동일한 LLOQ를 가진 중첩된 표준 곡선이 도출되었습니다(그림 8A). 또한 두 기기 간 표준 곡선의 상관관계는 R² 값 0.9966으로 매우 높았습니다(그림 8B).

요약

AAW™ 워크스테이션은 사용자 친화적인 인터페이스를 갖춘 로봇 액체 처리기로, 고처리량 및 기술적 워크플로우를 수행하여 작업자의 개입 시간을 줄일 수 있습니다. S^MC® 분석법의 핵심 액체 처리 및 배양 단계를 AAW™ 워크스테이션에서 수행하기 위한 자동화 프로토콜이 개발되었습니다. 세척 단계를 제외한 모든 분석 단계가 워크스테이션 상에서 수행되었습니다. AAW™ 워크스테이션은 세 번의 실행에서 수동 LLOQ(최소 검출 한계) 수준 또는 그 이상의 성능을 달성했으며, 숙련된 사용자의 수동 처리와 유사하거나 더 우수한 %CV(변동계수)를 보였습니다.

아래에서 AAW™ 워크스테이션에 대한 추가 정보를 요청하십시오.

팁과 요령

• AAW™ 워크스테이션에서 분석 단계를 숙지하기 위해 프로토콜의 드라이 런을 실행하는 것이 좋습니다. 드라이 런은 액체 없이 또는 물/완충액으로 실행할 수 있습니다. 드라이 런은 혼합 및 배양 단계를 단축하고, 추가 연습을 위해 팁을 랙으로 반환합니다.
• 분주 단계에서 팁이 웰 중앙에 위치하지 않을 경우, 적절한 위치 확인을 위해 실험용기 위치 점검을 재확인하십시오.
• 표준 분석 전용 플레이트를 실행할 경우, 비드 분주(1,000 μL 팁 랙, 12열), 검출 분주(1,000 μL 팁 랙, 11열), 용출/이송 단계(50 μL 팁 랙, 1-12열)에 사용되는 불필요한 팁을 팁 박스 행(D-H)에서 제거하여 시약 낭비를 최소화할 수 있습니다.
  • 표준만 실행에 필요한 최소 용량은 다음과 같습니다: 1x 비드 6mL, 1x 검출액 2.5mL, 용출 버퍼 B 2mL, 버퍼 D 2mL.
• AAW™ 자동화 분석 검출 및 용출 배양 단계에서는 알루미늄 플레이트 밀봉을 권장합니다. 플레이트 가장자리를 접어 덮개 탭을 고정하십시오.