샌저 시퀀싱 단계 및 방법
8월 12일 시험
샌저 시퀀싱이란 무엇인가?
“사슬 종결법”이라고도 알려진 샌저 시퀀싱은 DNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 방법입니다. 이 방법은 1977년에 두 차례 노벨상을 수상한 프레더릭 샌저와 그의 동료들이 개발했으며, 이에 따라 ‘샌저 시퀀싱’이라는 이름이 붙었습니다.
DNA의 일반적인 구조를 살펴보려면 그림 2를 참조하십시오.
샌저 시퀀싱은 어떻게 작동하나요?
샌저 시퀀싱은 수동으로 수행할 수도 있지만, 더 일반적으로는 시퀀싱 기기를 통해 자동화된 방식으로 수행됩니다(그림 1). 각 방법은 아래에 설명된 세 가지 기본 단계를 따릅니다.
그림 1.자동화 샌거 염기서열 분석의 세 가지 기본 단계.
샌저 시퀀싱 단계
샌저 시퀀싱에는 세 가지 주요 단계가 있습니다.
1. 사슬 종결 PCR을 위한 DNA 서열
분석 대상 DNA 서열은 사슬 종결 PCR이라고 하는 특수한 유형의 PCR에 대한 주형으로 사용됩니다. 사슬 종결 PCR은 표준 PCR과 똑같이 작동하지만, 디데옥시리보뉴클레오티드(ddNTP)라고 하는 변형된 뉴클레오티드(dNTP)가 추가된다는 한 가지 주요 차이점이 있습니다. 표준 PCR의 연장 단계에서, DNA 중합효소는 마지막 뉴클레오티드의 자유 3'-OH기와 다음 뉴클레오티드의 5'-인산기 사이에 인산디에스테르 결합의 형성을 촉매함으로써 성장 중인 DNA 가닥에 dNTP를 추가합니다(그림 2).
사슬 종결 PCR에서는 사용자가 PCR 반응 용액에 일반 dNTP와 소량의 사슬 종결 ddNTP를 혼합합니다. ddNTP에는 포스포디에스터 결합 형성에 필요한 3'-OH기가 없기 때문에, DNA 중합효소가 무작위로 ddNTP를 결합시키면 연장이 중단됩니다. 사슬 종결 PCR의 결과는 5'-ddNTP에 의해 무작위 길이(n)에서 종결된, 관심 있는 DNA 서열의 수백만에서 수십억 개에 달하는 올리고뉴클레오티드 사본입니다.
수동 샌거 시퀀싱에서는 4가지 PCR 반응을 설정하며, 각 반응에는 단 하나의 유형의 ddNTP(ddATP, ddTTP, ddGTP 및 ddCTP)만 혼합됩니다.
자동화된 Sanger 시퀀싱에서는 모든 ddNTP가 단일 반응에 혼합되며, 4가지 dNTP 각각에는 고유한 형광 표지자가 부여됩니다.
2. 젤 전기영동을 통한 크기 분리
두 번째 단계에서는 사슬이 종결된 올리고뉴클레오티드를 젤 전기영동을 통해 크기에 따라 분리합니다. 젤 전기영동에서는 DNA 시료를 젤 매트릭스의 한쪽 끝으로 주입한 후 전류를 가합니다. DNA는 음전하를 띠고 있으므로, 올리고뉴클레오티드는 젤 반대편에 있는 양극 쪽으로 끌려갑니다. 모든 DNA 단편은 질량 단위당 전하가 동일하므로, 올리고뉴클레오티드의 이동 속도는 크기만으로 결정됩니다. 단편이 작을수록 젤을 통과할 때 마찰을 덜 받게 되어 더 빠르게 이동합니다. 그 결과, 젤을 아래에서 위로 읽을 때 올리고뉴클레오티드는 가장 작은 것부터 가장 큰 것 순으로 배열됩니다.
수동 샌저 시퀀싱에서는 네 가지 PCR 반응 각각에서 나온 올리고뉴클레오티드를 젤의 네 개의 별도 레인에 주입합니다. 이를 통해 사용자는 어떤 올리고뉴클레오티드가 각 ddNTP에 해당하는지 파악할 수 있습니다.
자동화된 샌저 시퀀싱에서는 모든 올리고뉴클레오티드가 시퀀싱 기기 내의 단일 모세관 겔 전기영동에서 분석됩니다.
3. 젤 분석 및 DNA 서열 결정
마지막 단계는 단순히 젤을 판독하여 입력된 DNA의 서열을 결정하는 것입니다. DNA 중합효소는 제공된 프라이머를 기점으로 5’에서 3’ 방향으로만 DNA를 합성하기 때문에, 각 말단 ddNTP는 원본 서열의 특정 뉴클레오티드에 대응하게 됩니다(예: 가장 짧은 단편은 5’ 말단에서 첫 번째 뉴클레오티드에서 끝나야 하고, 두 번째로 짧은 단편은 5’ 말단에서 두 번째 뉴클레오티드에서 끝나야 하며, 이와 같이 이어집니다). 따라서 겔 밴드를 가장 작은 것부터 가장 큰 것 순으로 판독함으로써, 원본 DNA 가닥의 5’에서 3’ 방향 서열을 확인할 수 있습니다.
수동 Sanger 시퀀싱에서 사용자는 젤의 네 레인을 모두 한 번에 아래에서 위로 읽으며, 각 밴드의 말단 ddNTP를 확인하기 위해 레인을 사용합니다. 예를 들어, 맨 아래 밴드가 ddGTP에 해당하는 열에서 발견된다면, 가장 작은 PCR 단편은 ddGTP로 끝나며, 원본 서열의 5’ 말단에서 첫 번째 뉴클레오티드는 구아닌(G) 염기입니다.
자동화된 Sanger 시퀀싱에서는 컴퓨터가 형광을 이용하여 각 말단 ddNTP의 정체성을 판별하며, 모세관 젤의 각 밴드를 순서대로 판독합니다. 간단히 말해, 레이저가 각 밴드의 형광 표지를 여기시키고, 컴퓨터가 이에 따라 방출되는 빛을 감지합니다. 네 가지 ddNTP 각각에 서로 다른 형광 표지가 부착되어 있으므로, 방출된 빛은 말단 ddNTP의 정체와 직접 연결될 수 있습니다. 이 출력을 크로마토그램이라고 하며, 이는 템플릿 DNA의 길이에 따라 각 뉴클레오티드의 형광 피크를 보여줍니다.
그림 2.DNA 구조 도식도. DNA는 두 가닥이 서로 감겨 이중나선을 형성하는 분자입니다. 각 가닥은 데옥시리보뉴클레오티드(dNTP)라고 하는 분자들의 사슬로 이루어져 있습니다.
각 dNTP는 인산기, 당기, 그리고 네 가지 질소 함유 염기[아데닌(A), 티민(T), 구아닌(G), 시토신(C)] 중 하나를 포함하고 있습니다. dNTP들은 한 dNTP의 당과 다음 dNTP의 인산기 사이에 형성된 포스포디에스터 공유 결합을 통해 선형으로 연결되어 있으며, 이러한 반복되는 당-인산 구조가 당-인산 골격을 구성합니다.
두 개의 별도 가닥에 있는 질소 염기는 상보적인 염기 간의 수소 결합을 통해 서로 결합하여 이중 나선 DNA를 형성합니다.
Sanger 염기서열 분석 결과 해석 방법
Sanger 시퀀싱 결과를 올바르게 해석하는 것은 두 개의 상보적인 DNA 가닥 중 어느 쪽이 연구 대상인지, 그리고 어떤 프라이머를 사용할 수 있는지에 따라 달라집니다. 두 DNA 가닥을 A와 B라고 할 때, 가닥 A가 관심 대상이지만 프라이머가 가닥 B에 더 적합하다면, 출력된 단편은 가닥 A와 동일하게 나타납니다. 반면, 가닥 A가 관심 대상이고 프라이머가 가닥 A에 더 적합하다면, 출력 결과는 가닥 B와 동일하게 나타납니다. 따라서 출력 결과를 다시 가닥 A로 변환해야 합니다.
따라서, 관심 대상 서열이 “TACG”이고 프라이머가 해당 가닥에 가장 적합하다면, 결과 서열은 “ATGC”가 되므로 이를 다시 “TACG”로 변환해야 합니다. 그러나 프라이머가 상보적인 가닥(“ATGC”)에 더 적합하다면, 결과 서열은 “TACG”가 되며, 이것이 올바른 서열입니다.
요컨대, 시작하기 전에 무엇을 목표로 하는지, 그리고 그 목표에 어떻게 도달할지 미리 파악해야 합니다! 이를 염두에 두고, 앞서 언급한 예시(TACG → ATGC → TACG)를 다시 살펴보겠습니다. 디데옥시뉴클레오티드 표지 색상이 T = 노란색, A = 분홍색, C = 진한 파란색, G = 연한 파란색이라고 가정하면, 최종적으로 primer-A, primer-AT, primer-ATG, primer-ATGC라는 짧은 서열들이 생성됩니다. 단편들이 전기영동으로 분리되면, 레이저가 길이 순서(분홍색, 노란색, 연한 파란색, 진한 파란색)대로 단편들을 판독하여 크로마토그램을 생성합니다. 컴퓨터가 문자를 변환하므로, 최종 서열은 올바른 TACG가 됩니다.
샌저 시퀀싱 대 PCR
샌저 시퀀싱과 PCR은 유사한 출발 물질을 사용하며 서로 병행하여 사용할 수 있지만, 어느 한쪽도 다른 쪽을 대체할 수는 없습니다.
PCR은 DNA 전체를 증폭하는 데 사용됩니다. 우연히 다양한 길이의 단편이 생성될 수 있지만(예: DNA 중합효소가 분리될 수 있음), 목표는 전체 DNA 서열을 복제하는 것입니다. 이를 위해 필요한 “재료”는 표적 DNA, 뉴클레오티드, DNA 프라이머, 그리고 DNA 중합효소(특히 PCR에 필요한 고온에서도 생존할 수 있는 Taq 중합효소)입니다.
반면, 샌저 시퀀싱의 목표는 표적 DNA의 전체 길이에 이르는 모든 가능한 길이의 DNA를 생성하는 것입니다. 그렇기 때문에 PCR 시작 물질 외에도 디데옥시뉴클레오티드가 필요합니다.
Sanger 시퀀싱 프로토콜을 위한 시초 물질을 생성할 때 Sanger 시퀀싱과 PCR을 결합할 수 있습니다. PCR을 사용하여 시퀀싱할 DNA의 복제본을 다수 생성할 수 있습니다.
작업에 사용할 템플릿이 하나 이상 있으면 샌저 시퀀싱 프로토콜의 효율이 높아집니다. 표적 서열의 길이가 1,000 뉴클레오티드이고 템플릿 사본이 단 하나뿐이라면, 1,000개의 태그가 부착된 단편을 생성하는 데 더 오랜 시간이 걸릴 것입니다. 그러나 템플릿 사본이 여러 개 있다면, 이론적으로 1,000개의 태그가 부착된 단편을 모두 생성하는 데 걸리는 시간은 더 짧아집니다.