세포외 기질 단백질 및 세포 배양 최적화를 위한 도구
세포외 기질(ECM)이란 무엇인가?
동물 세포 및 조직 배양 기술은 체외 세포배양 조건을 최적화하기 위해 지속적으로 개선되고 있습니다. 세포 배양 용기의 화학적 또는 물리적 변형인 세포외 기질(ECM) 단백질 코팅은 생체 내 세포 행동을 더 잘 모방하는 효율적인 방법으로 입증되었습니다. 여기에서는 이용 가능한 다양한 코팅 방법과 몇 가지 새로운 기술의 특징을 설명합니다.
1900년대에는 동물 조직을 유리 표면에서 배양했으나, 세척 절차가 까다로워 연구자들은 폴리스티렌으로 제작된 일회용 플라스틱 배양 용기를 실험하기 시작했습니다.1,2 그러나 플라스틱 배양 용기에는 다음과 같은 한계가 존재합니다:3
- 무혈청 배지에서 세포 성장 및 부착의 어려움
- 세포 형태, 극성 및 형태학적 변화
- 세포 증식 증가 및 분화 감소
- 호르몬 및 성장 인자에 대한 반응성 저하
이에 연구자들은 세포 부착, 성장 및 분화를 향상시킬 수 있는 생물학적 물질(생물학적 코팅)과 합성 고분자(화학적 코팅)로 용기를 코팅하기 시작했습니다. 코팅된 표면에서의 세포 성장은 평평한 2차원 플라스틱 표면에서 자라는 세포와 달리 자연 환경을 더 잘 재현합니다. 이 기술은 생리학적 2차원 환경 또는 2.5차원 세포 배양 조건으로 분류될 수 있습니다.
그림 1.세포외 기질 단백질이 존재하는 환경의 세포는 2차원 조건의 세포보다 생리학적으로 관련성이 높은 행동을 보인다.
생물학적(세포외 기질 단백질) 또는 화학적(폴리-라이신…) 코팅이 존재하는 환경에서 배양된 세포는 전통적인 2차원 세포 배양 조건에서 배양된 세포보다 생리학적으로 더 관련성 높은 행동을 보입니다.
ECM 단백질
조직은 단순히 세포가 빽빽하게 들어차 있는 것이 아닙니다. 대부분의 부피는 세포외 공간으로 구성되어 있으며, 세포외 기질(ECM)이라고 불리는 복잡한 단백질 망으로 채워져 있습니다. 대부분의 조직에서ECM의 구성 요소는섬유아세포에 의해 분비되며, 프로테오글리칸과 섬유 단백질(콜라겐, 젤라틴, 피브로넥틴, 라미닌)로 분류됩니다.4이러한 구성 요소는 구조적 지지력을 제공하고 세포 간 통신을 촉진합니다. 세포 표면의 막 관통 단백질인 인테그린은 세포의 세포골격과 ECM을 연결하며, 세포 증식, 형태, 접착 및 세포 사멸을 조절하는 신호 전달 경로를 활성화합니다.
라미닌
라미닌은 기저막의 주요 구성 성분이다. 이 단백질은 아황화 결합으로 연결된 세 개의 긴 폴리펩티드 사슬(α, β, γ로 명명됨)로 구성되며 비대칭적인 십자형 구조를 이룬다. 라미닌은 세포와 세포외기질(ECM)을 함께 붙이는 접착제 역할을 합니다. 콜라겐 결합, 세포 접착, 헤파린 결합 및 신경돌기 성장 단편을 위한 활성 도메인을 가지고 있습니다. 라미닌은 세포 성장, 이동성 및 신호전달 경로를 조절합니다.
그림 2.피브로넥틴의 구조.
피브로넥틴은 세포 접착 및 확산에 관여하는 다기능 단백질이다. 또한 세포 형태, 세포 이동, 세포골격 조직화, 지혈 및 상처 치유를 조절한다.
그림 3.기저막 구조, 여기에는 ECM 단백질인 라미닌, 콜라겐 및 피브로넥틴이 포함된다.
콜라겐
콜라겐은 포유류에서 가장 풍부한 단백질로, 전체 단백질 질량의 25%를 차지합니다. 글리신과 프롤린 잔기가 풍부한 나선형 구조로 배열된 세 개의 폴리펩티드 사슬(알파 사슬로 지정됨)로 구성됩니다. 20종 이상의 서로 다른 콜라겐이 존재하며, 그중 I형, II형, III형, V형 및 XI형 콜라겐은 결합 조직에서 흔히 발견되는 섬유상 콜라겐입니다. 콜라겐 IX형과 XII형은 섬유소 연관 콜라겐으로, 섬유소들을 서로 연결하고 세포외 기질의 구성 요소들과 결합합니다. 반면 콜라겐 IV형과 VII형은 기저막의 주요 부분을 구성하는 네트워크 형성 콜라겐입니다.⁵
조직 내에서 콜라겐은 구조적 지지력, 강도 및 탄성을 제공하며, 세포 배양에서는세포의 성장, 분화 및 이동 연구에 활용됩니다.⁶
젤라틴
젤라틴은 콜라겐에 존재하는 고분자량 수용성 단백질의 이질적 혼합물이다. 해당 피부, 힘줄, 인대 및 뼈를 물에 끓여 단백질을 추출한다. A형 젤라틴은 산 처리 조직에서, B형은 석회 처리 조직에서 유래한다.
돼지 피부에서 추출한 A형 젤라틴은 콜라겐의 산성 분해 과정을 통해 생성되며, 주로 글리신, 프롤린, 하이드록시프롤린으로 구성됩니다. 이 젤라틴은 삼중 나선 구조의 콜라겐이 분해된 후 무작위 코일 구조를 나타내며, N-말단 서열에서 B형 소 젤라틴과 차이가 있습니다.
젤라틴은 일반적으로 배아 줄기 세포 배양, 고환 세포 배양 및 신경 로제트 배양에 사용되는 세포 배양 플레이트 또는 접시의 세포 부착 및 코팅을 개선하는 데 사용됩니다.
비트로넥틴
비트로넥틴은 459개의 아미노산으로 구성된 당단백질로, 세포외기질(ECM)과 혈액에서 발견됩니다. 혈액 내에서는 75kDa의 단일 사슬 형태 또는 65kDa와 10kDa의 이중 사슬 형태로 순환합니다. 비트로넥틴은 다당류(글리코사미노글리칸) 및 프로테오글리칸과 상호작용하며 세포 접착 분자 역할을 합니다. 비록 비트로넥틴과 피브로넥틴은 유사한 기능을 가지며 세포 인식 서열인 Arg-Gly-Asp를 공유하지만, 구조적 및 면역학적 특성은 서로 다릅니다.9
비트로넥틴은 세포용해성 보체 경로의 억제제로 작용하며, 응고 경로에서 생리적 역할을 수행합니다. 또한 내피세포 및 종양세포의 이동, 증식, 분화 및 확산을 촉진합니다.
즉시 사용 가능한 사전 혼합 부착 인자 용액
당사의 즉시 사용 가능한 부착 인자 혼합 용액은 세포 배양 플라스크 및 플레이트 코팅을 위해 설계되어, ECM 코팅 표면에 의존하는 다양한 세포 유형의 부착, 분화 및 증식을 촉진합니다. 기존 세포 배양 방법은 다양한 부착 인자로 플레이트를 코팅하는 등 시간이 많이 소요되는 준비 단계를 포함하여 전체 분석 일정을 연장시킬 수 있습니다. 이 부착 인자 혼합 용액은 세포 배양 준비를 간소화하고, 최종 사용자의 최적화 작업을 줄이며, 필요한 단계 수와 시간을 최소화하고, 세척 시약 사용량을 절감하는 데 도움이 됩니다. 연구자들은 또한 플레이트 코팅 당일에 바로 분석을 시작할 수 있어, 두 번째 부착 인자를 적용하기 전에 하룻밤 기다릴 필요가 없습니다. 부착 인자 혼합 용액의 작업 농도는 10 x 96-웰 플레이트 사용에 최적화되어 있어 희석이 필요하지 않습니다.
부착 인자 혼합액 적용 분야
라미닌과 폴리-L-라이신(PLL), 폴리-L-오르니틴(PLO), 폴리-D-라이신(PDL)의 조합은 상피 및 신경 세포의 부착과 분화를 촉진하고 배양하는 데 흔히 사용됩니다. 이러한 혼합물은 실온에서 보관 가능하며, 단독 라미닌(영하 20˚C 보관 필요, 반복적인 동결-해동 주기로 변성되기 쉬움)에 비해 안정성이 높습니다. 세포가 폴리-L-라이신을 분해할 수 있는 경우, L-라이신의 과도한 흡수를 방지하기 위해 라미닌과 폴리-D-라이신 혼합물 사용을 권장합니다.
즉시 사용 가능한 라미닌 혼합물의 효과를 검증하기 위해, 신경 줄기 세포(NSCs)를 두 가지 코팅 방법으로 배양하여 비교했습니다. 표준 방법에서는 PLL/PLO/PDL과 라미닌을 함께 배양한 후 세척하고, 두 번째로 하룻밤 동안 배양했습니다. 새로운 간소화된 방법에서는 PLL(LPLL001), PLO(LPLO001) 또는 PDL(LPDL001)을 미리 혼합된 라미닌 코팅 용액과 함께 37°C에서 1시간 동안 배양했습니다. 결과는 즉시 사용 가능한 코팅 용액 혼합물을 사용한 NSC 부착 및 증식을 보여줍니다(그림 4-6).
그림 4.신경줄기세포 배양 분석법. A. 라미닌과 PDL을 미리 혼합한 코팅 용액을 37°C에서 1시간 동안 배양하여 준비한 코팅. B. PDL로 하룻밤 배양한 후 세척하고, 라미닌으로 다시 하룻밤 배양하여 준비한 코팅. C. 코팅 없이 TC 플레이트에서 48시간 동안 배양한 신경줄기세포(NSCs).
그림 5.신경 줄기세포 배양 분석법. A. 라미닌과 PLL을 혼합한 코팅 용액을 37°C에서 1시간 동안 배양하여 준비한 코팅. B. PLL로 하룻밤 배양한 후 세척하고, 라미닌으로 다시 하룻밤 배양하여 준비한 코팅. C. 코팅 없이 TC 플레이트에서 48시간 동안 배양한 신경 줄기세포(NSCs).
그림 6.신경줄기세포 배양 분석법. A. 라미닌과 PLO를 미리 혼합한 코팅 용액을 37°C에서 1시간 동안 배양하여 준비한 코팅. B. PLO로 하룻밤 배양한 후 세척하고, 라미닌으로 다시 하룻밤 배양하여 준비한 코팅. C. 코팅 없이 TC 플레이트에서 48시간 동안 배양한 신경줄기세포(NSCs).
당사의 피브로넥틴-젤라틴 코팅 용액 혼합물은 무혈청 또는 저혈청 배양에 사용하기 적합하며, 특히 HL-1 심근 세포주 및 내피 세포 배양에 유용합니다.
그림 7에서 다양한 세포주(BHK21 세포, CHO 세포, F9 세포 및 HL-1 심근 세포주)를 피브로넥틴/젤라틴 코팅 용액(FG001) 위에 배양하였습니다. 모든 세포주는 탁월한 부착 및 증식 능력을 보여주었으며, 이는 즉시 사용 가능한 피브로넥틴-젤라틴 코팅 용액의 효과를 입증합니다.
그림 7.피브로넥틴-젤라틴 코팅 용액을 이용한 세포주 배양. A. BHK21 세포 (햄스터 신장 유래 섬유아세포); B. CHO 세포 (중국산 햄스터 난소); C. F9 세포 (마우스 고환 배아암종); D. HL-1 심근 세포주 (SCC065).
즉시 사용 가능한 사전 혼합 부착 인자 용액은 세포 배양 분석을 위한 시간 절약형 효율적 대안을 제공하여, 연구자들이 플레이트 코팅 당일에 바로 실험을 시작할 수 있게 합니다. 제공된 실험 결과는 다양한 세포 유형에 대한 혼합액의 적합성을 입증하여, 간소화되고 성공적인 세포 배양 실험을 위한 가치 있는 도구로 자리매김합니다.
사이토소프트 플레이트
세포가 성장하는 기질의 강성은 세포 기능에 영향을 미칩니다.Cyto Soft® 플레이트는 생체적합성 실리콘의 얇은 층으로 코팅되어 있으며, 다양한 강성으로 광범위한 생리학적 범위를 커버합니다. 겔 표면은 단백질과 안정적인 공유 결합을 형성하여 부착 인자(ECM 구성 요소)로 겔을 코팅하고 세포를 배양하는 것을 용이하게 합니다.Cyto Soft® 플레이트는 다음과 같은 특성을 가집니다:
- 광학적으로 투명하며 자동형광이 낮음
- 실리콘 겔은 가수분해에 취약하지 않음
- 실리콘 겔은 안정적이며 건조되거나 팽창하지 않음
- 찢어짐이나 균열에 강함
- 장기간 보관 시 경도 거의 변화 없음
- 트립신 및 콜라게나제를 사용하여 세포를 수확할 수 있음
- 효소 처리 후 생화학적 분해에 대한 내성
세포 배양 내 기타 ECM 단백질
배양 표면을 ECM 단백질 및 합성 고분자로 코팅하는 것은 세포 행동에 큰 영향을 미친다. 관찰되는 반응은 세포 유형과 기질로 사용된 코팅 물질 모두에 의존한다. 부착 인자와 접촉한 세포는 더 오래 생존하며 혈청 인자 없이도 배양될 수 있다.³ 부착 인자는 성장 인자를 격리 및 저장하여 인자의 시공간적 조절을 제어하고 성장 인자 수용체와 ECM 수용체 간의 교류를 촉진한다. 또한 기계적 특성을 정의하고 허용 조건 하에서 세포 분화를 유도합니다. ECM 단백질은 성장 인자 신호와 시너지를 이루며 세포 표면 수용체를 통해 세포 내 신호전달을 유도합니다.12 세포 배양이 발전함에 따라, 생체 내 조직 조건을 더 잘 모방하고 세포 간 세포외기질의 언어를 해독하기 위해 더 많은 구성 요소와 조합이 필요합니다.