Kit Transcriptor para síntesis de ADNc de alta fidelidad

Las transcriptasas inversas retrovirales utilizadas habitualmente para la síntesis de ADNc exhiben una mayor tasa de error que otras ADN polimerasa utilizadas en técnicas de análisis de ácidos nucleicos. Esta falta de precisión produce un número significativo de cambios de bases o mutaciones de desfase del marco de lectura, que se propagan luego en las reacciones de PCR consecutivas. Durante muchos años se ha dispuesto de enzimas de PCR de gran fidelidad (verificación y corrección); la nueva transcriptasa inversa de gran precisión de Roche es además capaz de sintetizar ADNc de longitud completa con gran rendimiento.
Una tasa elevada de mutación es el signo patognomónico de la replicación de los retrovirus. Esto tiene su origen en el mecanismo de replicación del genoma por la transcriptasa inversa codificada por el virus, que convierte el ARN genómico del virus en un ADN bicatenario (dsDNA). Durante este proceso, la transcripción inversa produce frecuentes errores de replicación. Una explicación aceptada para esta imprecisión es la carencia de actividad 3′-5′ exonucleasa de la transcriptasa inversa. La elevada tasa de error natural de las transcriptasas inversas no es óptima para muchas aplicaciones diferentes.

Mezcla de transcriptasas inversas de alta fidelidad Transcriptor para una RT-PCR en dos etapas de alta fidelidad de ARN de hasta 14 kb.

El componente nuclear del kit de síntesis de alta fidelidad de ADNc Transcriptor es la transcriptasa inversa de alta fidelidad Transcriptor, una mezcla de transcriptasa inversa recombinante y una enzima que interviene en la lectura de pruebas. La sinergia entre ambas enzimas es la clave de la capacidad de la mezcla enzimática para conseguir la transcripción inversa de moldes de ARN con una fidelidad siete veces superior a la obtenida con otras transcriptasas inversas habitualmente utilizadas.
La mezcla de transcriptasa inversa de alta fidelidad Transcriptor permite la transcripción inversa eficaz de moldes de hasta 14 kb. Debido a la gran termoestabilidad de los componentes enzimáticos y del sistema amortiguador especialmente optimizado, la transcripción inversa es posible a temperaturas de hasta +55 °C. Esto permite la transcripción inversa de moldes ricos en GC con mucha estructura secundaria, sin la necesidad de añadir aditivos que puedan influir de forma negativa en la precisión de la reacción de transcripción inversa.

La transcriptasa inversa recombinante incluida en la mezcla enzimática se expresa en E. coli. La enzima tiene actividad ADN polimerasa dirigida por ARN, actividad ADN polimerasa dependiente de ADN, actividad desenrolladora y actividad ARNasa H que degrada el ARN en los híbridos ARN:ADN. Esto último permite esquivar la necesidad de realizar una etapa añadida y larga de incubación con ARNasa H después de la transcripción inversa, reduciendo así el tiempo y los costes de la reacción.

El kit para síntesis de alta fidelidad de ADNc Transcriptor suministra todos los reactivos requeridos para las reacciones de síntesis de la cadena primaria del ADNc. Para el cebado, pueden utilizarse tres sistemas de cebado diferentes. Con el kit se suministran dos cebadores para síntesis de ADNc: cebadores hexámeros aleatorios y un cebador oligo (dT)₁₈ anclado. Este último está diseñado para unirse al principio de la cola poli(A) para generar ADNc de cadena completa y evitar el cebado a partir de sitios internos de la cola poli(A). Los extremos 5′ de los ARNm largos suelen estar infrarrepresentados, por lo que se prefiere este método de cebado para la mayoría de las aplicaciones. El uso de cebadores hexámeros aleatorios permite el cebado de toda la longitud del ARN para la representación uniforme de todas las secuencias de ARN, y permite la transcripción inversa de moléculas de ARN que no son portadoras de una cola poli(A). El inhibidor termoestable de la ARNasa Protector (incluido en el kit) protege al ARN de la degradación a temperaturas de reacción elevadas.

El kit Transcriptor para síntesis de ADNc de alta fidelidad está diseñado para conseguir la transcripción inversa del ARN con una mayor fidelidad que la conseguida con otras transcriptasas inversas. El kit consta de transcriptasa inversa de alta fidelidad Transcriptor, una mezcla de una transcriptasa inversa recombinante y una enzima que interviene en la lectura de pruebas optimizada para la RT- PCR en dos etapas, lo que hace que este producto sea idóneo para:

• Clonación de genes de interés
• Secuenciación de transcriptomas
• Generación de bancos de ADNc con insertos largos y de longitud completa
• Generación de análisis de expresión génica, como el análisis de empalme

Como el kit se ha aprobado también con los instrumentos LightCycler^® y otros instrumentos de PCR en tiempo real, el producto es también ideal para aplicaciones de RT- PCR cuantitativas que requieran alta fidelidad.
El kit contiene todos los componentes requeridos para la síntesis de un ADNc adecuado para su uso directo en la RT-PCR cualitativa con cicladores térmicos convencionales o la RT-PCR cuantitativa en instrumentos de PCR en tiempo real. El envase de 50 reacciones incluye también 10 reacciones control (ARN control y mezcla de cebadores de control).

Se prueba la función de cada lote del kit en un análisis para cuantificar la actividad de verificación y corrección y en una qRT-PCR en dos etapas para cuantificar la presencia de ARNm del PBGD en el ARN total de células K-562.

Figura 1: Precisión de la transcriptasa inversa de alta fidelidad Transcriptor y una transcriptasa inversa del M-MuLV comúnmente utilizada.
La tasa de error se determinó secuenciando con el sistema Genome Sequencer 20. Se realizó la transcripción inversa del ARN con la transcriptasa inversa de alta fidelidad Transcriptor y una transcriptasa inversa del M-MuLV comúnmente utilizada. Después de la purificación del ADNc y su amplificación con una polimerasa de prueba de lectura, se calculó la tasa de error de las transcriptasas inversas restando la tasa de error del control de PCR realizado con ADN plasmídico portador de la misma secuencia. La tasa de error de la transcriptasa inversa de alta fidelidad Transcriptor es el valor medio de cuatro experimentos independientes en los cuales se secuenciaron por lo menos 3,1 x 10⁶ bases. Para la transcriptasa inversa del M-MuLV, se secuenciaron 4,5 x 10⁶ bases.
La precisión se representa como una tasa de error -1, el número promedio de bases transcritas inversamente con éxito antes de que se produzca un único error de transcripción. La transcriptasa inversa de alta fidelidad Transcriptor muestra una mayor precisión que una transcriptasa inversa del M-MLuV convencional, lo que produce una menor tasa de error durante la síntesis del ADNc.

Figura 2: Comparación de diferentes transcriptasas inversas para la transcripción inversa del ARN total para diferentes tamaños de fragmento.
Se sometió a transcripción inversa un ARN total (1 μg procedente del ARN total de músculo humano para el fragmento de 2,3 kb; 1 μg procedente del ARN total de células HeLa para los fragmentos de 5,4 kb y 9,4 kb; 2 μg de ARN total de cerebro de rata para el fragmento de 12,4 kb) con diferentes transcriptasas inversas, de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes. Una alícuota de 5 μl de cada reacción ADNc se amplificó después utilizando el Expand Long Range dNTPack de Roche. Los resultados demuestran que el kit Transcriptor para síntesis de ADNc de alta fidelidad transcribe con eficacia una amplia variedad de tamaños de fragmentos con mayor rendimiento y especificidad que las transcriptasas inversas de otros proveedores.

Figura 3: Comparación de los diferentes tiempos de incubación para las reacciones del ADNc utilizando el kit Transcriptor de alta fidelidad para síntesis de ADNc.
Un microgramo de ARN total HeLa se transcribió inversamente a +50 °C durante los tiempos indicados. Alícuotas de 5 microlitros de las reacciones ADNc se amplificaron con cebadores para un fragmento de 8,5 kb utilizando el Expand Long Range dNTPack de Roche. Todas las reacciones se realizaron por duplicado. Los resultados demuestran que el kit Transcriptor de alta fidelidad para síntesis de ADNc transcribe con eficacia el ARN a gran velocidad y con gran precisión.

Figura 4: Comparación de los diferentes tiempos de incubación para las reacciones del ADNc utilizando el kit Transcriptor de alta fidelidad para síntesis de ADNc.
1 μg de ARN total HeLa transcribió inversamente a +50 °C durante los tiempos indicados. Alícuotas de 5 μl de las reacciones ADNc se amplificaron con cebadores para un fragmento de 8,5 kb utilizando el Expand Long Range dNTPack de Roche. Todas las reacciones se realizaron por duplicado

El kit Transcriptor de alta fidelidad para síntesis de ADNc incluye lo siguiente:

• Transcriptasa inversa de alta fidelidad Transcriptor (una mezcla de una transcriptasa inversa recombinante y una enzima que interviene en la lectura de pruebas)
• Tampón de reacción de alta fidelidad Transcriptor, concentrado x5
• Inhibidor de la ARNasa Protector
• Mezcla de dNTP, calidad para PCR
• Cebador oligo (dT)₁₈anclado
• Cebador de hexámero aleatorio
• DTT
• Agua, calidad para PCR
• ARN control – fracción de ARN total purificado a partir de la línea celular inmortalizada K-562*
• Mezcla de cebador de PBGD control (cebador directo e inverso)*

* Incluido sólo en el tamaño de envase de 50 reacciones.

Sólo para investigación en ciencias de la vida. No indicada para procedimientos de diagnóstico.

LightCycler is a registered trademark of Roche