세포 생존력 및 증식 분석
소개
세포 증식, 세포 생존력 및 세포 독성을 측정하는 분석법은 일반적으로 다양한 자극 처리 후 배양 중인 세포의 반응과 건강 상태를 모니터링하는 데 사용됩니다. 분석 방법의 적절한 선택은 사용되는 세포의 수와 유형, 예상 결과에 따라 달라집니다. 세포 증식 분석은 시간 경과에 따른 세포 수, 세포 분열 수, 대사 활동 또는 DNA 합성을 모니터링할 수 있습니다. 트리판 블루 또는 칼세인-AM과 같은 생존력 염료를 사용한 세포 계수는 증식 속도와 생존 세포의 비율을 모두 제공할 수 있습니다.
세포 생존력 및 증식 분석 개요
그림 1.A, BrdU 염색을 사용한 E4 병아리 배아의 눈 속 세포 증식 B, 캠토테신을 사용한 항-BrdU 항체 검증. 주르캇 세포를 세포주기 억제제 캠토테신으로 처리하면 순환 세포가 G1/S 상 전환기에 갇히게 됩니다.
EdU 증식 분석
Baseclick EdU 증식 분석은 복제 DNA의 형광 검출을 위한 효율적인 방법을 제공합니다. 변형된 뉴클레오시드 EdU는 살아있는 세포에 첨가되어 복제되는 DNA에 통합됩니다. Cu 유도 클릭 화학을 통해 형광 프로브를 EdU에 빠르게 부착할 수 있습니다. 이를 통해 증식 중인 세포를 정량적으로 모니터링할 수 있습니다. 이 분석은 현미경 이미징, 유세포 분석, 고처리량 스크리닝 및 생체 내 실험을 위한 다양한 형식으로 제공됩니다. 488, 555, 594, 647의 피크 여기를 가진 네 가지 형광 프로브는 다른 형광 프로브와 멀티플렉싱 기능을 사용할 수 있습니다.
그림 2.Edu-Click 세포 증식 키트는 활성 DNA 합성 중에 EdU(5-에티닐-2'-데옥시우리딘)를 DNA에 통합하고 클릭-화학 형광 검출 방법을 사용하여 측정합니다.
대사 증식 분석
대사 활동을 측정하는 분석은 증식, 생존력 및 세포 독성을 분석하는 데 적합합니다. 다음과 같은 테트라졸륨 염의 감소는 MTT, .XTT, WST-1은 대사 활성 세포에서만 유색 포마잔 화합물 또는 레사주린의 생체 환원이 일어납니다. 활발하게 증식하는 세포는 대사 활동이 증가하는 반면, 독소에 노출된 세포는 활동이 감소합니다.
MTT 세포 증식 분석
(3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸륨브로마이드, 티아졸릴 블루)는 수용성 테트라졸륨 염으로 페놀 레드가 없는 매체 또는 염 용액에서 준비하면 노란색 용액을 생성하는 수용성 테트라졸륨 염입니다. 용해된 MTT는 탈수소 효소에 의해 테트라졸륨 고리가 절단되어 불용성 보라색 포르마잔으로 전환됩니다. 이 불용성 포르마잔은 이소프로판올 또는 다른 용매를 사용하여 용해할 수 있으며, 용해된 물질은 전환된 염료의 농도에 따른 흡광도를 사용하여 분광광도계로 측정합니다.
XTT 세포 증식 분석
MTT와 달리, XTT의 절단 산물은 물에 용해되므로 가용화 단계가 필요하지 않습니다. 테트라졸륨 염 XTT는 복잡한 세포 메커니즘에 의해 포르마잔으로 분해됩니다. 이 생체 환원은 생존 가능한 세포에서만 발생하며 해당 작용을 통한 NAD(P)H 생성과 관련이 있습니다. 형성된 포르마잔 염료의 양은 배양액에서 대사 활성 세포의 수와 직접적인 상관관계가 있습니다.
WST-1 세포 증식 분석
안정한 테트라졸륨 염 WST-1은 주로 세포 표면에서 발생하는 복잡한 세포 메커니즘에 의해 용해성 포마잔으로 절단됩니다. 이러한 생체 환원은 주로 생존 세포에서 NAD(P)H의 해당 과정 생성에 따라 달라집니다. 형성된 포마잔 염료의 양은 배양액에서 대사적으로 활동하는 세포의 수와 직접적인 상관관계가 있습니다.
프로토콜 가이드: 세포 생존 및 증식을 위한 WST-1 분석. 프로토콜, FAQ 및 문제 해결
그림 3.MTT 분석은 대사 활동을 기반으로 세포 증식을 평가하는 비색 분석법입니다. NAD(P)H 의존성 세포 산화 환원 효소는 생존 가능한 세포의 수를 반영합니다. 이 효소는 노란색 테트라졸륨 염료 MTT 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드를 보라색을 띠는 불용성 포르마잔으로 환원할 수 있습니다.
발광 세포 생존력 분석
ATP는 대사 활성 세포의 지표이므로 사용 가능한 ATP의 양에 따라 생존 가능한 세포 수를 평가할 수 있습니다. ATP 세포 생존력 루시퍼라제 분석법은 세포 배양에서 ATP를 정량하기 위한 매우 민감한 균질 분석법을 제공합니다. 이 키트는 반딧불 루시퍼라제를 사용하여 D-루시페린을 산화시키고 그 결과 생성되는 빛을 이용하여 세포 배양에서 사용 가능한 ATP의 양을 평가합니다. 민감한 분석 절차는 혈청 보충 배지에서 배양된 세포에 직접 ATP 검출 칵테일을 한 번만 추가하면 됩니다. 세포 세척, 배지 제거 또는 여러 번의 피펫팅이 필요하지 않습니다. 이 키트는 단일 세포 또는 0.01 피코몰의 ATP를 검출할 수 있을 정도로 민감합니다. 생성되는 신호는 6배수 이내의 선형입니다. ATP의 양을 생존 세포 수와 연관시킴으로써 이 분석법은 생존 세포 수 측정부터 세포 증식, 세포 세포 독성에 이르기까지 폭넓게 응용할 수 있습니다.
그림 4.생물발광 ATP 루시퍼라제 세포 생존력 분석. 반딧불이 루시퍼라제가 ATP를 사용하여 D-루시페린을 산화시키고 그 결과 빛을 생성하여 세포 수 및 생존율과 상관관계가 있는 사용 가능한 ATP의 양을 평가합니다.
형광 염료 증식 분석
CFSE 라벨링
5(6)-카복시플루오레세인 디아세테이트 N-숙시니미딜 에스테르(CFSE)는 세포 집단이 겪는 분열의 수를 측정하는 데 널리 사용됩니다. 세포에 들어가면 CFSE는 세포 내 에스테라아제에 의해 절단되어 형광 화합물을 형성하고 숙시니미딜 에스테르 그룹은 세포 내 단백질의 1차 아민과 공유 결합하여 반응합니다. 세포 분열 시 각 딸세포의 형광 강도가 절반으로 줄어들어 유세포 분석법으로 세포 분열 횟수를 간단하게 검출할 수 있습니다. CFSE는 T세포를 포함한 림프구의 증식을 측정하는 데 널리 사용되고 있습니다.
생/사 세포 이중 염색
생/사 세포 이중 염색은 생존 세포와 사 세포의 동시 형광 검출에 활용될 수 있습니다.칼세인-AM은 친유성 및 세포막 투과성이 높은 염료입니다. 칼세인-AM 자체는 형광 분자가 아니지만, 생존 세포에서 에스테라아제에 의해 칼세인-AM에서 생성된 칼세인은 강한 녹색 형광(λex 490nm, λem 515nm)을 발산합니다. 반면, 핵 염색 염료인 프로피듐 요오드는 생존 세포막을 통과할 수 없습니다. 죽은 세포막의 무질서한 영역을 통과하여 핵에 도달하고, DNA 이중 나선과 상호 결합하여 적색 형광(λex 535nm, λem 617nm)을 발산합니다. 칼세인과 PI-DNA 모두 490nm 빛으로 여기할 수 있기 때문에 단일 여기 형광 현미경으로 살아있는 세포와 죽은 세포를 동시에 모니터링할 수 있습니다.
그림 5.생세포/사세포 이중 염색
3D 세포 배양- 살아있는/죽은/전체 세포 트리플 염색
<세포 생존력 이미징 키트
- 칼세인-AM 대사 활성 생존 세포에만 존재하는 에스테라제 활성에 의존하여 칼슘 결합 시 녹색 형광을 발합니다.
- 프로피듐 요오드화물(PI)은 살아있는 세포의 막에서는 배제되지만 죽은 세포의 손상된 막을 통과하여 DNA와 결합하여 강한 적색 형광을 방출하는 핵 염료입니다.
- 호에치스트 33342는 낮은 세포 독성을 나타내는 DNA 염색 염료입니다. 파란색으로 형광을 띠며 총 세포 수를 나타내는 지표로 사용됩니다.
Trypan Blue 세포 계수
Trypan Blue는 생존 세포 계수를 위한 염료 배제 절차에 사용하도록 권장되는 여러 염색 중 하나입니다. 이 방법은 살아있는(생존 가능한) 세포는 파란색 염료를 흡수하지 않는 반면, 죽은(생존 불가능한) 세포는 흡수한다는 원리를 기반으로 합니다. 세포 생존율은 총 생존 세포/총 세포(살아있는 세포와 죽은 세포)의 비율을 사용하여 계산할 수 있습니다. 또한 염색은 전체 세포 형태를 시각화하는 데 도움이 됩니다.
주: Trypan Blue는 세포 단백질보다 혈청 단백질에 대한 친화력이 더 높습니다. 매트릭스에 혈청이 존재하여 배경이 너무 어두우면 세포를 펠릿화하여 단백질이 없는 배지 또는 염 용액에 다시 현탁시킨 후 계수해야 합니다.
