Kit de detección de oxidación de proteínas OxyBlot

Preparación del lisado celular

1. Lave las células adherentes en la placa o matraz dos veces con PBS helado y escurra el PBS. Lave las células no adherentes en PBS y centrifugue entre 800 y 1000 rpm en una centrífuga de sobremesa durante 5 minutos hasta que las células sedimenten.
2. Añada tampón RIPA helado a las células (1 ml por 107 células/100 mm de placa/150 cm2 matraz; 0,5 ml por 5 x 106 células/60 mm de placa/75 cm2 matraz).
3. Raspe las células adherentes de la placa o el matraz con una varilla de policía o un raspador de células de plástico que se haya enfriado en agua destilada helada. Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga. Agite suavemente la suspensión en una plataforma basculante o un agitador orbital en la sala fría durante 15 minutos para lisar las células.
4. Centrifugue el lisado a 14 000 x g en una centrífuga preenfriada durante 15 minutos. Transfiera inmediatamente el sobrenadante a un tubo de centrífuga fresco y deseche el sedimento.
5. Diluya el lisado celular por lo menos 1 : 10 antes de determinar la concentración de proteínas debido a la interferencia de los detergentes del tampón de lisis con el reactivo Coomassie. En esta etapa, la muestra puede dividirse en alícuotas y conservarse a -20¡C durante un mes.
Consejo: Cuando se trabaja con grandes volúmenes de células no adherentes, puede que las células no se enfríen con suficiente rapidez como para mantener la actividad de la proteína en estudio. En este caso, vierta la suspensión celular en una mezcla de una masa igual de 2 x PBS y hielo, luego recoja las células por centrifugación y realice la lisis como se acaba de describir.

Tampón para lisis RIPA:
El agente reductor número de referencia 20-188
http://www.millipore.com/catalog/item/20-188

es muy importante para prevenir la oxidación:
El lisado proteico puede prepararse utilizando una variedad de protocolos. La mayoría de los tampones estándar como RIPA y Triton también son adecuados. Se recomienda añadir un reductor al tampón de lisis para evitar la oxidación de las proteínas que puede producirse después de la lisis celular. El tampón de lisis que contiene 2-mercaptoetanol al 1-2 % o DTT 50 mM inhibe suficientemente esta oxidación, pero no tiene ningún efecto adverso sobre la reacción de derivatización en el protocolo OxyBlot . Las muestras de proteínas purificadas también son adecuadas para el análisis con el kit OxyBlot .

Si desea información general sobre la extracción de proteínas, consulte este enlace.

http://www.millipore.com/immunodetection/id3/proteinextraction

Salvo que se indique lo contrario en nuestro catálogo o en otra documentación de la empresa que acompañe al producto, nuestros productos están indicados sólo para investigación y no deben utilizarse para ningún otro propósito, como, entre otros, usos comerciales no autorizados, diagnóstico in vitro, usos terapéuticos ex vivo o in vivo o cualquier tipo de consumo o aplicación en humanos o animales.

La modificación oxidativa de las proteínas por radicales libres de oxígeno y otras especies reactivas ocurre en procesos fisiológicos y patológicos. Como consecuencia de la modificación, se introducen grupos carbonilo en las cadenas laterales de las proteínas mediante un mecanismo específico de sitio. El kit OxyBlot proporciona reactivos para la inmunodetección sencilla y sensible de estos grupos carbonilo, que es un sello distintivo del estado de oxidación de las proteínas.

Almacene la proteína patrón (componente 90450) entre -25° y -15°C al recibirlo. Almacene todos los demás componentes entre 2°C y 8°C.

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