Pasos y método de la secuenciación de Sanger
Pruebas del 12 de agosto
¿Qué es la secuenciación de Sanger?
La secuenciación de Sanger, también conocida como «método de terminación de cadena», es un método para determinar la secuencia de nucleótidos del ADN. El método fue desarrollado en 1977 por Frederick Sanger, dos veces premio Nobel, y sus colegas, de ahí el nombre de «secuenciación de Sanger».
Para repasar la estructura general del ADN, consulta la figura 2.
¿Cómo funciona la secuenciación de Sanger?
La secuenciación de Sanger puede realizarse manualmente o, lo que es más habitual, de forma automatizada mediante una máquina de secuenciación (figura 1). Cada método sigue tres pasos básicos, tal y como se describe a continuación.
Figura 1.Tres pasos básicos de la secuenciación automatizada por Sanger.
Pasos de la secuenciación por Sanger
La secuenciación por Sanger consta de tres pasos principales.
1. Secuencia de ADN para la PCR de terminación de cadena
La secuencia de ADN de interés se utiliza como molde para un tipo especial de PCR denominada PCR de terminación de cadena. La PCR de terminación de cadena funciona igual que la PCR estándar, pero con una diferencia importante: la adición de nucleótidos modificados (dNTP) denominados didesoxirribonucleótidos (ddNTP). En la etapa de extensión de la PCR estándar, la ADN polimerasa añade dNTP a una cadena de ADN en crecimiento al catalizar la formación de un enlace fosfodiéster entre el grupo 3'-OH libre del último nucleótido y el 5'-fosfato del siguiente (Figura 2).
En la PCR de terminación de cadena, el usuario mezcla una proporción reducida de ddNTP de terminación de cadena con los dNTP normales en la reacción de PCR. Los ddNTP carecen del grupo 3'-OH necesario para la formación del enlace fosfodiéster; por lo tanto, cuando la ADN polimerasa incorpora un ddNTP de forma aleatoria, la extensión se detiene. El resultado de la PCR de terminación de cadena son entre millones y miles de millones de copias de oligonucleótidos de la secuencia de ADN de interés, terminadas en longitudes aleatorias (n) por los 5’-ddNTP.
En la secuenciación manual de Sanger, se preparan cuatro reacciones de PCR, cada una de ellas con un único tipo de ddNTP (ddATP, ddTTP, ddGTP y ddCTP) mezclado.
En la secuenciación Sanger automatizada, todos los ddNTP se mezclan en una única reacción, y cada uno de los cuatro dNTP cuenta con un marcador fluorescente único.
2. Separación por tamaño mediante electroforesis en gel
En el segundo paso, los oligonucleótidos con terminación de cadena se separan por tamaño mediante electroforesis en gel. En la electroforesis en gel, las muestras de ADN se cargan en un extremo de una matriz de gel y se aplica una corriente eléctrica; el ADN tiene carga negativa, por lo que los oligonucleótidos serán atraídos hacia el electrodo positivo situado en el lado opuesto del gel. Dado que todos los fragmentos de ADN tienen la misma carga por unidad de masa, la velocidad a la que se desplazan los oligonucleótidos vendrá determinada únicamente por su tamaño. Cuanto más pequeño sea un fragmento, menor será la fricción que experimentará al desplazarse por el gel y más rápido se moverá. Como resultado, los oligonucleótidos quedarán ordenados de menor a mayor tamaño, leyendo el gel de abajo hacia arriba.
En la secuenciación manual de Sanger, los oligonucleótidos de cada una de las cuatro reacciones de PCR se someten a electroforesis en cuatro carriles separados de un gel. Esto permite al usuario saber qué oligonucleótidos corresponden a cada ddNTP.
En la secuenciación Sanger automatizada, todos los oligonucleótidos se someten a una única electroforesis capilar en gel dentro de la máquina de secuenciación.
3. Análisis del gel y determinación de la secuencia de ADN
El último paso consiste simplemente en leer el gel para determinar la secuencia del ADN de partida. Dado que la ADN polimerasa solo sintetiza ADN en la dirección 5’ a 3’ a partir de un cebador proporcionado, cada ddNTP terminal se corresponderá con un nucleótido específico de la secuencia original (por ejemplo, el fragmento más corto debe terminar en el primer nucleótido desde el extremo 5’, el segundo fragmento más corto debe terminar en el segundo nucleótido desde el extremo 5’, etc.). Por lo tanto, al leer las bandas del gel de menor a mayor, podemos determinar la secuencia de 5’ a 3’ de la cadena de ADN original.
En la secuenciación manual por Sanger, el usuario lee las cuatro bandas del gel a la vez, de abajo hacia arriba, utilizando la banda para determinar la identidad del ddNTP terminal de cada banda. Por ejemplo, si la banda inferior se encuentra en la columna correspondiente al ddGTP, entonces el fragmento de PCR más pequeño termina en ddGTP, y el primer nucleótido desde el extremo 5’ de la secuencia original tiene una base de guanina (G).
En la secuenciación automatizada de Sanger, un ordenador lee cada banda del gel capilar, en orden, utilizando la fluorescencia para determinar la identidad de cada ddNTP terminal. En resumen, un láser excita los marcadores fluorescentes de cada banda y un ordenador detecta la luz emitida resultante. Dado que cada uno de los cuatro ddNTP está marcado con un marcador fluorescente diferente, la luz emitida puede relacionarse directamente con la identidad del ddNTP terminal. El resultado se denomina cromatograma, que muestra el pico fluorescente de cada nucleótido a lo largo de la longitud del ADN molde.
Figura 2.Esquema de la estructura del ADN. El ADN es una molécula compuesta por dos cadenas que se enrollan una alrededor de la otra para formar una doble hélice. Cada cadena está formada por una sucesión de moléculas denominadas desoxirribonucleótidos (dNTP).
Cada dNTP contiene un grupo fosfato, un grupo de azúcar y una de las cuatro bases nitrogenadas [adenina (A), timina (T), guanina (G) o citosina (C)]. Los dNTP se encadenan de forma lineal mediante enlaces covalentes fosfodiéster entre el azúcar de un dNTP y el grupo fosfato del siguiente; este patrón repetido de azúcar-fosfato constituye la cadena principal de azúcar-fosfato.
Las bases nitrogenadas de las dos cadenas separadas se unen entre sí mediante enlaces de hidrógeno entre bases complementarias para formar la hélice de ADN de doble cadena.
Cómo interpretar los resultados de la secuenciación de Sanger
La interpretación correcta de los resultados de la secuenciación de Sanger dependerá de cuál de las dos cadenas complementarias de ADN sea la de interés y de qué cebador se disponga. Si las dos cadenas de ADN son A y B y nos interesa la cadena A, pero el cebador es más adecuado para la cadena B, los fragmentos obtenidos serán idénticos a los de la cadena A. Por el contrario, si nos interesa la cadena A y el cebador es más adecuado para la cadena A, el resultado será idéntico al de la cadena B. Por lo tanto, el resultado debe reconvertirse a la cadena A.
Así pues, si la secuencia de interés es «TACG» y el cebador es el más adecuado para esa cadena, el resultado será «ATGC» y, por lo tanto, deberá reconvertirse a «TACG». Sin embargo, si el cebador es más adecuado para la cadena complementaria («ATGC»), el resultado será «TACG», que es la secuencia correcta.
En resumen, antes de empezar, ¡tienes que saber cuál es tu objetivo y cómo vas a alcanzarlo! Teniendo esto en cuenta, he aquí un ejemplo del caso anterior (TACG → ATGC → TACG). Si los didesoxinucleótidos están marcados con T = amarillo, A = rosa, C = azul oscuro y G = azul claro, se obtendrán las secuencias cortas «cebador-A», «cebador-AT», «cebador-ATG» y «cebador-ATGC». Una vez que los fragmentos se han separado mediante electroforesis, el láser leerá los fragmentos por orden de longitud (rosa, amarillo, azul claro y azul oscuro) y generará un cromatograma. El ordenador convertirá las letras, de modo que la secuencia final sea la correcta: TACG.
Secuenciación de Sanger frente a PCR
La secuenciación de Sanger y la PCR utilizan materiales de partida similares y pueden emplearse de forma conjunta, pero ninguna de ellas puede sustituir a la otra.
La PCR se utiliza para amplificar el ADN en su totalidad. Aunque pueden producirse accidentalmente fragmentos de distintas longitudes (por ejemplo, la ADN polimerasa podría desprenderse), el objetivo es duplicar la secuencia completa de ADN. Para ello, los «ingredientes» son el ADN diana, los nucleótidos, el cebador de ADN y la ADN polimerasa (concretamente, la polimerasa Taq, que puede soportar las altas temperaturas que requiere la PCR).
Por el contrario, el objetivo de la secuenciación de Sanger es generar todas las longitudes posibles de ADN hasta alcanzar la longitud completa del ADN diana. Por eso, además de los materiales de partida de la PCR, son necesarios los didesoxinucleótidos.
La secuenciación de Sanger y la PCR pueden combinarse a la hora de generar el material de partida para un protocolo de secuenciación de Sanger. La PCR puede utilizarse para crear numerosas copias del ADN que se va a secuenciar.
Disponer de más de una plantilla con la que trabajar hace que el protocolo de Sanger sea más eficiente. Si la secuencia objetivo tiene una longitud de 1 000 nucleótidos y solo hay una copia de la plantilla, se tardará más en generar los 1 000 fragmentos marcados. Sin embargo, si hay varias copias de la plantilla, en teoría se tardará menos tiempo en generar los 1 000 fragmentos marcados.