Solución de problemas relacionados con la contaminación en cultivos celulares
Prueba del 12 de agosto
Resumen
Tipos de contaminación
Causas habituales y prevención de los contaminantes
Microbianos (bacterias, hongos, levaduras)
Micoplasma
Contaminación
viral Contaminación
química Consejos y técnicas
generales Trabajar en la cabina
de seguridad biológica Pipeteo y prevención de aerosoles
Desinfección
Cómo realizar un seguimiento rutinario de las células sanas
Contaminación de cultivos: una visión
general
Aunque la «contaminación de cultivos celulares» suele evocar imágenes de bacterias entre las células y medios turbios, los invasores no deseados en el frasco de cultivo pueden adoptar muchas formas. Los contaminantes virales y químicos también pueden tener consecuencias considerables para la salud del cultivo, y garantizar que las líneas celulares no sufran contaminación cruzada es fundamental para la reproducibilidad de los resultados.
¿Hasta qué punto está extendida la contaminación celular? Según estudios de la FDA, la ATCC y otras entidades, se estima que entre el 5 % y el 30 % de todos los cultivos celulares actuales están contaminados solo con especies de micoplasma. La incidencia de la contaminación viral en líneas celulares comunes superó el 25 % en un estudio5, y los virus no citopáticos tienen aún más probabilidades que el micoplasma de pasar desapercibidos, ya que el estado del cultivo puede no ofrecer indicios de su presencia.
Figura 1.Contaminación celular
La clave para controlar un contaminante específico suele estar relacionada con la facilidad con la que se detecta. Los contaminantes bacterianos, fúngicos y de levaduras suelen ser visibles a simple vista y pueden matar rápidamente las células en cultivo, pero una morfología sutil puede hacer que los intrusos microbianos importantes, como el micoplasma, sean más difíciles de identificar. En comparación, los virus no pueden detectarse en absoluto mediante microscopía óptica convencional y, por lo tanto, su descubrimiento suele deberse a observaciones de desprendimiento inexplicable u otros signos de mal estado de las células o incluso de muerte celular.
Una de las principales preocupaciones a las que se enfrenta la comunidad biológica en los últimos años es la contaminación o incluso la identificación errónea de las líneas celulares de investigación. Para obtener más información sobre este importante tema, haz clic aquí para comprender las causas y la prevalencia de la contaminación cruzada en las líneas celulares, así como la forma de evaluar la integridad de la identidad de las líneas celulares.
La contaminación bacteriana, fúngica (incluido el moho) y por levaduras suele ser visible a simple vista como una turbidez de aparición rápida y un cambio de color del medio de cultivo (siempre que el medio esté enriquecido con rojo de fenol, el indicador de pH no tóxico más habitual). La microscopía óptica estándar también permite detectar células bacterianas y estructuras fúngicas, por lo que la observación microscópica diaria de los cultivos garantizará la detección precoz de la contaminación microbiana y permitirá tomar las medidas adecuadas tan pronto como aparezcan los primeros signos. En particular, es necesario retirar rápidamente los cultivos contaminados para proteger a los cultivos vecinos, así como el entorno estéril del cultivo de tejidos, incluidas las incubadoras de cultivo, los baños y la cabina de bioseguridad. Además, deben realizarse pruebas específicas para detectar bacterias y hongos como parte de un procedimiento de control de calidad rutinario y periódico.
Causas comunes y prevención de la contaminación microbiana
Los micoplasmas son un género de bacterias que carecen de pared celular y, por lo tanto, no se ven afectados por los antibióticos que limitan el crecimiento bacteriano al inhibir la formación de la pared celular. Su morfología flexible y su tamaño celular, que oscila entre 0,15 y 0,3 µm, hacen que puedan escapar a los métodos habituales de filtración en cultivos celulares, que suelen utilizar filtros con poros de 0,22 µm. A diferencia de la mayoría de los demás contaminantes bacterianos, los micoplasmas no se aprecian a simple vista y son difíciles de detectar mediante microscopía óptica debido a su morfología y a su tamaño notablemente pequeño. El título de micoplasmas en un cultivo puede alcanzar los 10⁸ organismos/mL sin provocar turbidez en el medio. Por lo general, no matan a las células de mamífero que infectan, pero afectan significativamente a los cultivos al alterar el metabolismo celular, provocar aberraciones cromosómicas, ralentizar el crecimiento celular e interferir en la adhesión celular. En resumen, es probable que influyan drásticamente en los resultados de la mayoría de los experimentos realizados con líneas celulares afectadas.
Figura 2.Los agentes habituales para la detección de ADN, como el DAPI o el Hoechst, revelan la presencia de micoplasmas en cultivos contaminados (derecha) mediante microscopía de fluorescencia.
Las diversas fuentes de contaminación por micoplasmas en el laboratorio pueden suponer un reto. Dado que ciertas especies de micoplasmas se encuentran en la piel humana, pueden introducirse mediante técnicas asépticas deficientes, además de a través de suplementos contaminados, como el suero fetal bovino. Los micoplasmas son altamente transmisibles entre cultivos celulares contaminados adyacentes. Para el tratamiento de los micoplasmas es necesario filtrar los medios y tampones con membranas que tengan poros de 0,1 µm o menos, ya que los dispositivos estándar de filtración de medios con poros de 0,22 o 0,45 µm no logran retener estos pequeños organismos.
Prevención, detección y eliminación de la contaminación por micoplasmas
Una vez que el micoplasma contamina un cultivo, puede propagarse rápidamente a otras zonas del laboratorio. Es fundamental cumplir estrictamente las buenas prácticas de laboratorio, y se recomienda encarecidamente realizar pruebas rutinarias de detección de micoplasma para controlar con éxito la contaminación por micoplasma. Los tres métodos más habituales para la detección son el cultivo de micoplasmas, el método de tinción de ADN y la detección basada en la PCR. Ofrecemos una variedad de soluciones para la detección y eliminación de micoplasmas. Es fundamental establecer una rutina de cribado de micoplasmas en los cultivos, incluso si no se sospecha la presencia de este contaminante en el laboratorio.
Prevención de la contaminación microbiana: ¿son los antibióticos la solución? Una de las prácticas habituales en el cultivo de tejidos es el uso rutinario de antibióticos, ya sea solos o en combinación con antifúngicos. Al igual que ocurre con los antibióticos terapéuticos recetados por los médicos, el uso continuado o inadecuado de antibióticos puede dar lugar al desarrollo de cepas resistentes que son difíciles de erradicar y que pueden requerir el uso de antibióticos de última generación, que a su vez pueden resultar tóxicos para los cultivos celulares. Estudios recientes han suscitado nuevas preocupaciones sobre la posibilidad de que se altere la expresión génica en las células cultivadas en presencia de antibióticos. |
Contaminación viral
Los virus se encuentran entre los contaminantes más difíciles de detectar en los cultivos celulares, lo que requiere métodos de microscopía que resultarían poco prácticos para la mayoría de los laboratorios de investigación. Pueden proceder del paciente o de la fuente celular del animal huésped, y se ha demostrado que varias líneas celulares de importancia biotecnológica contienen retrovirus endógenos. Lo más habitual es que las células se infecten con virus presentes en los materiales de origen animal utilizados para su cultivo. El pequeño tamaño de los virus hace que sea muy difícil eliminarlos de los medios de cultivo, los sueros y otras soluciones de origen biológico. Sin embargo, dado que la mayoría de los virus están restringidos a un huésped concreto e incluso a un tejido específico, esto puede limitar su capacidad de infección entre especies o entre tejidos. Aunque los virus pueden ser más comunes en los cultivos celulares de lo que muchos investigadores creen, pueden suponer o no un factor de confusión significativo para el cultivo celular si no provocan efectos citopáticos u otros efectos adversos en las células.
Más allá de su potencial para afectar a las células cultivadas, una de las principales preocupaciones al utilizar cultivos celulares infectados por virus es el posible riesgo para la salud que suponen para el personal de laboratorio. Siempre deben adoptarse precauciones de seguridad especiales al trabajar con tejidos o células de seres humanos u otros primates, a fin de evitar la posible transmisión de infecciones virales (VIH, hepatitis B, virus de Epstein-Barr, virus del herpes B simio, entre otros) desde los cultivos celulares al personal de laboratorio. Se debe consultar a los responsables de seguridad ambiental de la institución en relación con los procedimientos para trabajar con tejidos, cultivos o virus potencialmente peligrosos. Para obtener más información sobre la evaluación de riesgos para el personal de laboratorio que trabaja con cultivos celulares, haz clic aquí
Buenas prácticas para reducir la incidencia de la contaminación viral de los cultivos celulares:
*Limitar el número de fuentes biológicas (proveedores, animales) de las que se extraen las células.
*Seleccionar animales o células menos susceptibles a los virus.
*Obtener las células de bancos que realicen pruebas de detección de virus y proporcionen certificación de que las líneas celulares están libres de virus.
Contaminación química
Cualquier contaminante no vivo de un cultivo celular suele clasificarse como contaminante «químico». Estos contaminantes pueden proceder de los reactivos o del agua utilizados en los medios o tampones, o bien del equipo y los suministros. Algunos ejemplos son los radicales libres, los iones metálicos, los residuos de desinfectantes o detergentes, o incluso las endotoxinas que persisten una vez que los contaminantes bacterianos iniciales ya no están presentes.
Consejos para prevenir la contaminación química:
*Utilice siempre agua de grado de laboratorio para preparar tampones y soluciones, y para resuspender reactivos liofilizados.
*Todo el material de laboratorio reutilizable debe enjuagarse a fondo y secarse al aire; la esterilización en autoclave no tendrá ningún efecto sobre los residuos de detergente.
*Adquiera medios de cultivo, suplementos y suero (FBS, FCS) exclusivamente de proveedores que proporcionen certificación de pruebas de endotoxinas.
Consejos y técnicas generales para prevenir y eliminar la contaminación
Trabajar dentro de la cabina de seguridad biológica
Al trabajar dentro de la cabina de bioseguridad, conviene recordar que el flujo de aire es fundamental para mantener un entorno estéril. Tanto las rejillas de ventilación traseras como las delanteras deben mantenerse despejadas en todo momento para lograr un flujo de aire eficaz. Antes de cualquier procedimiento práctico, la cabina debe estar provista de todos los materiales necesarios con el fin de minimizar el riesgo de transferencia de contaminantes a través de las mangas y las manos del operador.
Deben transcurrir al menos veinte minutos desde que se inicia el flujo de aire antes de introducir en la cabina los artículos que se vayan a utilizar. Todos los artículos que entren en la cabina deben rociarse primero con alcohol estéril al 70 % (v/v) y limpiarse con toallitas que no suelten pelusa para evitar que el polvo y las partículas entren en la cabina. Asegúrate de que el flujo de aire esté bien establecido antes de abrir cualquier tapa o recipiente, para permitir que el flujo de aire purgue el área de trabajo de las partículas que puedan haberse introducido.
Figura 3.Trabajar en una cabina de seguridad
Pipeteo y prevención de aerosoles
Las pipetas de plástico desechables —también denominadas pipetas serológicas, disponibles en capacidades de entre 1 y 100 ml— son herramientas indispensables para el cultivo celular. Deben estar envueltas individualmente para garantizar su esterilidad. El cumplimiento de las siguientes directrices puede minimizar la contaminación y los riesgos de seguridad asociados al pipeteo.
- Utilice dispositivos de pipeteo automáticos, limitando el uso de cada uno de ellos a una única cabina. Para evitar la contaminación, desmonte y desinfecte las piezas del dispositivo de pipeteo con regularidad. Asegúrese de que los filtros del dispositivo de pipeteo estén siempre bien abastecidos y se cambien con regularidad.
- Utilice pipetas tapadas (tapadas en la parte superior con algodón) siempre que sea posible, especialmente al transferir medio de cultivo. Evite aspirar líquido hacia el tapón de la pipeta. Si el tapón se moja accidentalmente, cambie el filtro del dispositivo de pipeteo inmediatamente.
- Evite tocar la pipeta serológica por completo desenvolviéndola parcialmente, acoplando el extremo al dispositivo de pipeteo y retirando después la funda de papel.
- Para evitar la generación de aerosoles contaminantes, no se deben crear burbujas en el medio ni en la pipeta.
Desinfección
Los métodos diseñados para la desinfección o descontaminación de residuos de cultivo, superficies de trabajo y equipos no solo deben minimizar el riesgo de contaminación, sino que también deben ser seguros para el personal del laboratorio. Utilice siempre equipo de protección individual (EPI) adecuado, como guantes y protección ocular, al emplear desinfectantes concentrados. Los guantes elegidos deben proteger contra la sustancia que se manipula. Las tablas de los fabricantes le ayudarán a identificar los guantes más adecuados para una tarea concreta. Los principales desinfectantes se clasifican en grupos, y sus ventajas relativas pueden resumirse de la siguiente manera:
Hipoclorito de sodio o lejía
- Buen desinfectante de uso general
- Eficaz contra los virus
- Es corrosivo para los metales; no debe utilizarse en superficies metálicas, como las centrífugas
- Se inactiva fácilmente con la materia orgánica, por lo que debe prepararse con frecuencia
- Utilizar lejía comercial para preparar una solución al 10 % (v/v) en líquidos residuales o para la desinfección de superficies
Alcohol (p. ej., etanol, isopropanol)
- Concentraciones eficaces: 70 % para el etanol, 60-70 % para el isopropanol
- Eficaz contra las bacterias. El etanol es eficaz contra la mayoría de los virus, pero no contra los virus sin envoltura
- El isopropanol no es eficaz contra los virus
- Los aldehídos son irritantes, por lo que su uso debe limitarse
Deben evitarse los desinfectantes de base fenólica, ya que no están contemplados en el programa de revisión de la Directiva de la UE sobre productos biocidas.
Cómo realizar un seguimiento rutinario de las células sanas
El seguimiento de los cultivos celulares es una parte importante del trabajo diario con cultivos celulares. Este tutorial te ayudará a comprender los conceptos básicos del seguimiento de tus células, incluyendo cómo es un cultivo sano, la confluencia celular y las diferentes fases del crecimiento de los cultivos celulares. Este vídeo también mostrará los indicadores habituales de contaminación bacteriana y por micoplasmas.