間葉系幹細胞膨張培地（1x）

細胞の融解：

1.推奨される培地および適切なプラスチック器具やガラス器具が揃うまで細胞を融解しないでください。
2.間葉系幹細胞のバイアルを液体窒素から取り出して、37°Cの水槽で培養します。 細胞が完全に融解するまでよく監視してください。 最大細胞生存率は、凍結細胞が迅速かつ完全に融解したかどうかに依存します。 重要： 細胞をボルテックスしないでください。
3.細胞が完全に融解したら、速やかにバイアルの外側を70%エタノールで消毒します。 すぐに次のステップに進んでください。
4.ラミナーフローフード内で1または2 mLピペットを使用して、細胞を無菌の15 mLコニカルチューブへ移します。 移す際に気泡が混入しないよう注意してください。
5.10 mLピペットを使用して、9 mLの間葉系幹細胞膨張培地（37°Cで予め温めておく）を15 mLコニカルチューブへゆっくり滴下して添加します。 重要： 全容量の培地を一度に細胞へ添加しないでください。 浸透圧衝撃に起因する細胞生存率の低下を招くおそれがあります。
6.ピペットによる吸い出しをゆっくり2回繰り返して、細胞懸濁液を穏やかに混合します。 気泡が混入しないよう注意してください。 重要： 細胞をボルテックスしないでください。
7.300 x gで2～3分間チューブを遠心分離して、細胞をペレット状にします。
8.できるだけ多くの量の上清をデカントします。 残留する冷凍保存剤（DMSO）を取り除くには、ステップ4～8が必要です。
9.10 mL総量の間葉系幹細胞膨張培地（37°Cまで予め温めておく）で細胞を再懸濁します。
10.細胞混合物を10 cm組織培養プレートに塗布します。
11.5% CO₂湿式インキュベーター内で細胞を37°Cで培養します。
12.翌日、新鮮な間葉系幹細胞膨張培地（37°Cまで予め温めておく）と交換します。 その後は2～3日毎に新鮮な培地と交換してください。
13.細胞が約80%コンフルエントであればAccutase^®で細胞を分解でき、さらに継代するか、または後で使用するために凍結できます。

二次培養：

1.間葉系幹細胞の融合層を含む10 cm組織培養プレートから培地を慎重に取り除きます。
2.3～5 mLのAccutaseを添加してから、37°Cのインキュベーター内で3分間培養します。
3.プレートをよく調べ、プレートの側面を掌で軽くたたいて細胞が完全に剥離していることを確認します。4.5 mLの間葉系幹細胞膨張培地（37°Cまで予め温めておく）をプレートに添加します。
5.解離細胞を15 mLコニカルチューブへ移します。
6.300 x gで2～3分間チューブを遠心分離して、細胞をペレット状にします。
7.上清を廃棄します。
8.2 mLの間葉系幹細胞膨張培地をコニカルチューブに添加し、細胞を完全に再懸濁します。重要： ボルテックスしないでください。
9.血球計を用いて細胞数をカウントします。
10.適切なフラスコ、プレートまたはウェルの間葉系幹細胞膨張培地に、希望の密度で細胞を塗布します。 通常は、10 cmプレートまたはT75フラスコあたり約200万個の細胞を塗布します。

間葉系幹細胞膨張培地は、胎児ウシ血清を含む独自の調合物です。

間葉系幹細胞膨張培地は、-20°Cで使用直前まで保存できます。 解凍した基礎培地は、2～8°Cで最長1か月保存できます。

各ロットの培地は、間葉系幹細胞の最適な細胞成長および増殖がテストされています。 無菌性試験： 陰性

Accutase is a registered trademark of Innovative Cell Technologies, Inc.

CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany

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