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ミリセル（Millicell® ）プレート

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薬物輸送アッセイ
Merck:/Freestyle/BI-Bioscience/Cell-Culture/cell-culture-images/0329046-71[8706-ALL].jpgセルベースアッセイは、正常状態ならびに病的状態、両方のメカニズムを理解するために必要不可欠です。Millicell 24ウェルおよび 96ウェルフィルタープレートは薬物輸送アッセイに最適です。

薬物輸送アッセイ関連製品の詳細は
こちらをご覧ください。

ミリセル 24/96ウェルセルカルチャーインサートプレート

ミリセル セルカルチャーインサートプレートは、内皮細胞株ならびに CaCo-2を含む上皮細胞株の細胞増殖や分化をサポートする特許取得設計のデバイスです。

ミリセルのデバイスは、0.4 µm PCF ならびに様々なPETメンブレン孔径があります。このプレートは、最大限の利便性を考慮して設計し、容易なピペット操作とバソラテラルのアクセスのためにアピカルサポートなどの特長を取り入れています。単層のコンタミネーションリスクを減らすため、メンブレンプレートはフィーダートレイから取り出すときに作業面上に接触しないよう、プレート側面に足があります。涙のしずくの形をしたレシーバーウェルは、プレートを組み合わせるときに気泡を除去します。

特許取得のアピカルならびにバソラテラルアクセスポートは、細胞単層にコンタミネーションフリーのアクセスを実現します。細胞のフィーディングや培地交換、サンプル分析も簡素化します。バソラテラルアクセスポートは、バソラテラルでサンプル採取をするアッセイシステムを分解する必要がないため、輸送速度解析の途中で特に効果的です。各ウェルならびにバソラテラルアクセスホールはオートメーション化されたプローブを使いやすくするために一列に並んでいます。
Merck:/Freestyle/BI-Bioscience/Cell-Culture/new-cell-culture-images/MillicellMultiwell_InsertPlates.jpgこのオートメーション対応プレートは、アッセイの完全性を保つ特許取得の設計を組み入れ、解析中の細胞層の破壊やコンタミネーション、損傷を防ぎます。96ウェルの増殖アセンブリーは96ウェルかシングルウェルのフィーダートレイから選択できます。この形状は24ウェルでもお使いいただけます。ミリセルプレートは、高品質の細胞単層を増殖ならびに維持するために最適化されています。ミリセルのプレートメンブレンで増殖した細胞の状態は、アピカルとバソラテラルの両側から栄養分を与えられるためプラスチックの場合よりも良好です。in vivoにより近い細胞増殖と機能が再現されます。ミリセルプレートは、細胞増殖と解析を目的として設計されており、手動または自動での細胞播種、フィーディング、洗浄システムが使用できます。


ミリセルプレートは、高品質の細胞単層を増殖ならびに維持するために最適化されています。ミリセルのプレートメンブレンで増殖した細胞の状態は、アピカルとバソラテラルの両側から栄養分を与えられるためプラスチックの場合よりも良好です。細胞増殖と機能は、in vivoにより近い状態に再現します。ミリセルプレートは、細胞増殖と解析用に設計されており、手動または自動での細胞播種、フィーディング、洗浄システムが使用できます。

Merck:/Freestyle/BI-Bioscience/Cell-Culture/new-cell-culture-images/ImprovedCellMorphology.jpg Merck:/Freestyle/BI-Bioscience/Cell-Culture/new-cell-culture-images/ImprovementAttachment-Growht_graph.jpg
再構成バソラテラルメンブレン（RBM）を添着したプラスチックプレートとメルク のメンブレンで培養したセルトリ細胞の比較において、メルクのメンブレン上で増殖した細胞（下）は、核が卵型またはピラミッド型の丈の高い柱状の単層を形成しました。
透不透過性の組織培養プラスチックプレートとメルクのメンブレン（ミリセルHAインサート）で増殖した MDCK細胞の比較。このグラフは、細胞の付着や増殖が起きた領域と、コンフルエントに達した領域を示しています。両条件共に、1.7x105細胞/cm2の初期密度で細胞を播種しました。ミリセル HAインサートにおいて認められた細胞数の増加は、背の高い柱状細胞が増殖したことを示しています。


ひとつのメンブレン―ボトムプレートで、細胞増殖、フィード、解析までできます。プレートは、シングルウェルとマルチウェルのフィーディングトレイどちらでも使用できます。化合物の輸送解析をする際は、フィルタープレートを解析のためマルチウェルトランスポートトレイへ移します。

Merck:/Freestyle/BI-Bioscience/Cell-Culture/cell-culture-images/915101-06[8209-ALL].jpgこの効率化設計で、次のような機能を高めます：
  • 播種および培地交換
  • 自動分注システムとマルチピペット
  • 細胞へのバソラテラル側ならびにアピカル側からのアクセス
  • 経上皮電気抵抗（TEER）測定システム
  • 細胞培養アッセイや解析を向上させる設計
自動化に対応した特長
in vitro 毒性

特長
利点
他の24ウェルのメンブレンベースプレートと比べメンブレンの表面積が2倍 アッセイの感度と細胞増殖が向上
ミリセル 24プレートは、アピカルならびにバソラテラルチャンバーの液体量が推奨されている 1：2の比率になっていますが、他のプレートでは最大 1：6になっています。 透過した化合物の希釈倍率が低いときに結果の差が小さければ、シグナルがより高く、感度もより高いということになります。
盛り上がったウェルエッジ テープの密閉力を強化
大きな数字と文字でナンバリングされたウェル 読みやすく特定しやすい
高い細孔密度の0.4µm PCFメンブレン 高度に分化したCaco-2細胞が通り抜けることなく増殖可能
1.0µmの透明PETメンブレン 顕微鏡下で生細胞の観察が可能
アピカルおよびバソラテラルアクセスホール 経時透過解析を実施する間のサンプルアクセスが容易
アピカルアシストチャネル マニュアルアッセイ実施中に単層の破壊とメンブレンの損傷を防ぐ
HTSフォーマット
脚付きフィルタープレート 作業台に乗せても無菌性を保持

ご注文情報
主要なプロトコール
細胞播種＆フィーディングガイドライン
  • 細胞播種のガイドライン
    ミリセル 24セルカルチャーインサートプレート
    細胞の播種プロトコールならびに密度の最適化を行うことは、ミリセル24セルカルチャーインサートプレートで優れた細胞付着と増殖を確保するために極めて重要です。播種の密度範囲を最初に検討することをお勧めします。次のガイドラインは、ひとつのデバイスで実施するためのもので、オートメーションを使用しての実施も可能です。このプロトコールでは、播種や増殖の途中で細胞を観察することが可能な 0.4µm ポリカーボネート（PCF）メンブレンまたは 1.0µmポリエステル（PET）メンブレンのMillicell 24プレートを使用しました。

    材料と試薬
    • ミリセル24セルカルチャーインサートプレート（PCFまたは PETメンブレン）― カタログ番号PSHT 010 R5、PSRP 010 R5
    • 組織培養フラスコ
    • ステリフリップ（Steriflip）GPまたはステリカップ（Stericup） GPフィルターユニット― カタログ番号 SCGP 005 25または SCGP U11 RE
    • 0.02% EDTA — カタログ番号 20-307
    • 1x トリプシン/EDTA — カタログ番号 SM-2002-C または SM-2003-C
    • 細胞培地―カタログ番号 SLM-022-B
    • 滅菌の1 mLのピペットチップ、ピペッター、マイクロチューブ／マイクロ遠心チューブ、たらい
    • 血球計算盤またはその他のセルカウンター

    注：次の方法はCaco-2やMDCKなどの付着性上皮細胞株の播種ならびにメンテナンス用に最適化されていますが、他の方法や細胞株を使用したプレートの処理における基本原則も含まれています。

    方法
    播種密度の最適化

    1. 37℃、5–6％のCO2、95％の相対湿度に設定した細胞培養インキュベーターのＴ-75フラスコで細胞を増殖、培養します。細胞の分離や継代の前に、80–90%のコンフルエンスに到達することが可能です。その後のミリセル24プレートにおける単層形成に影響するため、オーバーコンフルエント（ >90%）にならないよう気をつけてください。

      注：細胞継代の数は最適な単層の形成に影響します。そのため、新しい株が確立するまでCaco-2 細胞が20代以上継代しないようにしてください。同様に、MDCK細胞は40継代以上にならないようにしてください。

    2. 培地を吸引除去し、5 mL 0.02% EDTAでT-75フラスコ、3～5分間インキュベーションします。0.02% EDTAを吸引除去した後、1.5 mLのトリプシン/EDTA 溶液を加えます。37°Cでおよそ5～15分間、または細胞が剥離して浮遊するまでインキュベーションします。フラスコの定期的に目視することで確認できます。

    3. 細胞が剥離したら新しい培地を加え、すべての細胞塊が分散するまで混ぜます。血球計算盤などのセルカウンターを使用して細胞数をカウントし、その数を元に細胞株のストックを維持するため細胞を継代します。正確に計数するため、よく細胞を撹拌します。

      *このプロトコールにおけるガイドラインは、ミリセル24セルカルチャープレートに特化したものです。シングルウェルインサートやミリセル96セルカルチャープレートを使用する場合は、このガイドラインに変更を加える必要があります。製品の選択に合わせて、液体の添加量を調整するには、推奨使用容量表を参照してください。

      注：細胞株の播種密度を最適化するには、プレート間の細胞濃度範囲を6または8倍で使用することをお勧めします。

    4. 滅菌済み遠心チューブを用いて、細胞懸濁液を目的の播種密度範囲になるように培地で希釈します。播種密度を決定するために望ましい目安は、表面積における倍率と現在の細胞密度を掛けて算出します。　

      例： 9mmのミリセルインサート（表面積 =0.3cm²）の播種密度が 60,000個/ウェルであれば、ミリセル24セルカルチャーインサートプレート（表面積 =0.7cm²）の播種密度は、60,000に2.3を乗じた値として計算されます。

      0.7 cm²/0.3 cm²=2.3
      60,000 細胞/ウェル x 2.3=138,000 細胞/ウェル

      そのため、適切な範囲は、使用した細胞株によって120,000～160,000細胞／ウェルになります。次の表は、 3日間培養する MDCKの播種と 21日間培養する Caco-2細胞単層について、メルクで最適化した播種密度（ 3つの単位で）の一覧です。

      注：播種密度の目安が無い状態で開始した場合、最初は「細胞播種密度変換表」に記載の数値周辺での播種密度範囲内にします。

      注： 最初に細胞播種するときに均一な細胞懸濁液を作製すると、 24ウェル全体でさらに均一な単層の形成が促進されます。これは複数のプレートを播種するときには特に難しいことです。細胞が播種作業中にチューブの底に沈んでしまいウェル間やプレート間で細胞の分布が不正確になることを防ぐため、頻繁に混ぜることを推奨します。

    5. ミリセル24プレートの目的のフィルターウェルに、300µLの各播種密度の細胞を添加します（フィーディング密度範囲の図を参照）。プレートの右下にある大きなアクセスホールを通じて、シングルウェルフィーダープレートへ28mLの培地を加えます。あるいは、フィーダープレートからフィルタープレートを取り外します。クリーンベンチの無菌表面にフィルタープレートを置き、フィーダープレートに直接培地を追加します。2つのプレートを丁寧に組み合わせなおし、インキュベーターに入れます。

      注：ミリセル24プレートに播種した細胞は、適切な湿度管理を行うインキュベーターに置きます。電子湿度管理の付いた細胞培養インキュベーターをお勧めします。不可能であれば、プレートを入れるインキュベーターの中に水を満たしたバットを置き、インキュベーターを頻繁に開けないようにしてください。


    Merck:/Freestyle/BI-Bioscience/Cell-Culture/cell-culture-images/PS3390EN00_EM.jpg 

    ミリセル 24カルチャープレート―細胞播種密度変換表
    個/cm²
    個/mL（0.4ml）
    個/ウェル
    21日間Caco-2播種密度 85,700 150,000 60,000
    3日間MDCK播種密度 714,000 1,250,000 500,000

  • 細胞フィーディングのガイドライン
    注：最適な細胞増殖のためには、2日に一度増殖培地を交換することをお勧めします。ミリセル24プレートの培地を取り除き交換する際に最も重要な点は、単層細胞と単層細胞をサポートしているフィルターを傷つけないようにすることです。これは、アピカルアシストの機能を活用し、滅菌の1 mLピペットチップを使用して実施できます。

    1. 滅菌済み1mLピペットチップを使用してフィーダープレート（バソラテラル）から大きなアクセスホールより培地を取り除くか、フィーダープレートからフィルタープレートを取り外した後に培地を取り除きます。

    2. アピカルアシストの機能を使用してフィルターウェルから培地を吸引除去します。培地を取り除いたり加えたりするときに、ウェル内のフィルターに触れないよう気をつけてください。フィーダープレート（バソラテラル）に28 mLの培地を戻す前に、フィルターウェル（アピカルアシスト）に300 µLの増殖培地を戻します。

      注：フィルタープレートの“脚”を使用して作業台にフィルタープレートを置いた場合、インキュベーターから取り出した後15秒間は作業台にアセンブリー全部を置いておくことをお勧めします。15秒後にプレートを取り外せば、メンブレンの裏面で液滴が形成されて作業台表面に触れる可能性を最小限に抑えることができます。

      注：播種密度の評価は、通常経上皮電気抵抗（TEER）による単層の完全性の試験か、ルシファーイエロー（LY）輸送の評価、あるいは標準的な薬剤化合物を使用して実施するのが一般的です。


  • 単層の完全性測定ならびに薬剤輸送ガイドライン


    ミリセル24セルカルチャーインサートプレートは、細胞の増殖、付着、分化その他のアプリケーションをサポートするために設計された24ウェルの多目的デバイスです。分化された細胞単層の形成ならびに細胞バリアを渡った薬剤輸送速度の測定方法は、下記に詳述しています。手順はすべてひとつのデバイスを使って行う設計ですが、もしお望みであれば、細胞播種、細胞フィーディング、洗浄その他の実験手順はオートメーションを使用して実施することも可能です。

    材料と試薬
    • ミリセル24セルカルチャーインサートプレート（PCFまたはPETメンブレン）― カタログ番号PSHT 010 R5、PSRP 010 R5
    • ミリセルERSシステム―カタログ番号 MERS 000 01
    • 24ウェルレシーバープレート―カタログ番号 PSMW 010 R5
    • 24ウェルフィーダートレイ―カタログ番号 PSSW 010 R5
    • ルシファーイエロー、100µg/mL
    • ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）
    • 放射性薬剤輸送：
    • Wallac/Perkin Elmer 96ウェルフレキシブルプレート
    • Microbeta Trilux Counterまたは同様の製品
    • シンチレーションカクテル

    注：次の方法は、Caco-2やMDCKのような上皮細胞株において、単層の一体化と細胞ベースの薬剤輸送のために最適化されていますが、他の適用可能な細胞システムにも応用することができます。

    方法
    単層の完全性測定

    A. 経上皮電気抵抗 (TEER)
    1. 適当な培養期間後インキュベーターからプレートを取り出し、室温に戻します（およそ0.5時間）。
    2. ミリセルERSシステムを使用して単層全体の電気抵抗を測定します。短い方の電極はフィルターウェルの中の培地に浸し、長い方の電極はバソラテラルアクセスホールを通じて増殖プレートの中の培地に置きます。


    各ウェルの電気抵抗を記録します。TEERの測定の間、フィルターに触れないように気をつけてください。細胞単層を傷つける場合があります。

    注：細胞単層が存在しないウェルを測定してバックグラウンドTEERとし、細胞のTEER値の生データから引くこともできます。

    B. ルシファーイエロー（LY）阻止率
    1. 培地交換のときと同じ方法で、アピカルウェルでは300 µLのHBSSで単層を3度洗い流し、28 mL でフィーダートレイを洗い流します。
    2. フィルタープレートの各ウェルにLY溶液300 µLを追加します。
    3. 24ウェルのレシーバートレイの各ウェルへ600 µLのHBSSを追加します。
    4. フィルタープレートと24ウェルレシーバープレートを組み合わせ、37°Cで1～2時間インキュベーションします。
    5. レシーバープレートからフィルタープレートを取り除き、蛍光プレートリーダーにレシーバープレートを置きます。485 nmの励起波長ならびに535 nmの発光波長を使用してLYの蛍光強度を判断します。
    6. レシーバープレートの蛍光強度を測定して“平衡に達した”スタンダードと比較することで、細胞単層の LY阻止率を計算します。

      注：スタンダードプレートは、600µL HBSS（ブランク）4ウェルと200µL LY（100µg/mL）＋400µL HBSS（平衡サンプル）4ウェルで構成します。


    細胞薬剤輸送テンプレート（4種類の化合物、3系列（トリプリケート）での実施）

    フィルタープレート（アピカル）テンプレート
    300 µL 薬剤 1 300 µL 薬剤 1 300 µL 薬剤 1 300 µL 薬剤 2 300 µL 薬剤 2 300 µL 薬剤 2
    300 µL HBSS 300 µL HBSS 300 µL HBSS 300 µL HBSS 300 µL HBSS 300 µL HBSS
    300 µL 薬剤 3 300 µL 薬剤 3 300 µL 薬剤 3 300 µL 薬剤 4 300 µL 薬剤 4 300 µL 薬剤 4
    300 µL HBSS 300 µL HBSS 300 µL HBSS 300 µL HBSS 300 µL HBSS 300 µL HBSS


    レシーバープレート（バソラテラル）プレート
    600 µL 薬剤 1 600 µL 薬剤 1 600 µL 薬剤 1 600 µL 薬剤 2 600 µL 薬剤 2 600 µL 薬剤 2
    600 µL HBSS 600 µL HBSS 600 µL HBSS 600 µL HBSS 600 µL HBSS 600 µL HBSS
    600 µL 薬剤 3 600 µL 薬剤 3 600 µL 薬剤 3 600 µL 薬剤 4 600 µL 薬剤 4 600 µL 薬剤 4
    600 µL HBSS 600 µL HBSS 600 µL HBSS 600 µL HBSS 600 µL HBSS 600 µL HBSS



    次の方程式を使用してLY阻止率を計算します：

    Merck:/Freestyle/BI-Bioscience/Cell-Culture/cell-culture-images/PS3390EN00_EM.jpg 

    この式を使用して LY透過率を計算します：

    Merck:/Freestyle/BI-Bioscience/Cell-Culture/cell-culture-images/plates-calculation-2.bmp

    例：それぞれの数値の測定値が次の値である場合：

    Merck:/Freestyle/BI-Bioscience/Cell-Culture/cell-culture-images/plates-calculation-3.bmp

    LY透過率は次のようになります：

    Merck:/Freestyle/BI-Bioscience/Cell-Culture/cell-culture-images/plates-calculation-4.bmp

    よって、 LY阻止率は次のように計算されます：

    Merck:/Freestyle/BI-Bioscience/Cell-Culture/cell-culture-images/plates5.bmp

    注：細胞播種プロトコールは通常、平均電気抵抗が最大でばらつきが最少（CVが最少）となる密度、かつ LY透過率が最も低い条件を選択することで最適化されます。播種密度の最適化の後は、 TEERの測定値や LY阻止率、またはアテノロールやマンニトールなどの傍細胞性薬物を使用して単層の完全性試験を実施することができます。

    注：LY阻止率を薬剤輸送と合わせて実施することはお勧めしません。放射分析やLC/MS 分析を干渉する可能性があるためです。単層の一体化を評価するため、LY透過後薬剤輸送を実施することをお勧めします。

    細胞ベース薬剤輸送：
    1. 目的の細胞増殖期間後、インキュベーターからミリセル24プレートを取り出し、各ウェルの電気抵抗値を測定します（上記参照）。細胞単層を洗浄し、滅菌HBSS（pH7.4）を使用して溶液を三度交換します。洗浄後、フィルタープレートとフィーダートレイからバッファーを取り除きます。
    2. フィルタープレートを 24ウェル輸送解析プレートに載せます。
    3. アピカルからバソラテラル方向の薬剤輸送率を判断するため、フィルターウェルへ試験化合物300 µLを追加します。通常10µM～200µMの範囲の薬剤濃度を使用します（HBSS（pH7.4）または望ましいpHの代替バッファー を使用して目的の濃度に調整）。
    4. 600 µL のバッファーで24ウェルレシーバープレートのウェルを満たします。
    5. アピカルからバソラテラル方向の薬剤輸送率を判断するため、24ウェルレシーバープレートへ試験化合物600 µLを追加します。
    6. 300 µL のバッファーでウェル（アピカル側）を満たします。
    7. すべての薬剤とバッファーが添加されたら、フィルターとレシーバープレートを組み合わせます。実験の時間を計り始めます。
    8. ロータリーシェーカーで60 rpmで振とうさせて37°Cでインキュベーションします。一般的なインキュベーション時間は1～2時間です。最適な結果を得るためには、２時間のインキュベーションをお勧めします。
    9. LC/MS解析：インキュベーションの最後に、アピカルとバソラテラルウェルから直接（バソラテラルアクセスホールを使用して）、またはプレートを解体して固定量（通常50–100 µL）を回収します。清潔なプレートへその容量を移します。


    RIラベルの薬剤評価：各ウェルから 25µLまたは適切な分量を取り、100µLのシンチラントが入ったプレートに移します。混合し、Perkin ElmerのTriluxなどのマルチウェルプレートシンチレーションリーダーを使用してサンプルごとに放射活性を測定します。スタンダードとしては、100µLのシンチレーション液に25µLの初期薬剤を加えたものを使用します。

    薬剤輸送率の計算
    ミリセル 24プレート薬剤輸送アッセイにおけるセンチメートル毎秒を単位とした見掛輸送率は、次の式を使用して計算することができます。

    Merck:/Freestyle/BI-Bioscience/Cell-Culture/cell-culture-images/PS3390EN00_EM.jpg

    式中の：
    VA=アクセプターウェル内の溶液量
    Area=メンブレンの表面積（ミリセル 24プレートでは 0.7cm²）
    Time=輸送時間の秒数

    RIラベル薬剤輸送実験では、薬剤アクセプターや初期濃度に、Triluxマルチウェルプレートシンチレーションカウンターで測定したCPM単位を直接使用するので、式は以下のようになります：

    Merck:/Freestyle/BI-Bioscience/Cell-Culture/cell-culture-images/PS3390EN00_EM.jpg

    注： Caco-2またはMDCK単層の分化は、ジゴキシンならびにビンブラスチンのような流出する化合物の輸送によって評価されます。（BからA）/（AからB）の比は、アピカル側の細胞膜でのP糖タンパク質（P-gp）の発現および局在の測定に適しています。播種密度の最適化は、単層の分化によっても評価されます。

    注：細胞単層の増殖、完全性、分化は、薬剤輸送分析に使われるアッセイを最適化する際、注意深くモニタリングする必要があります。アッセイのばらつきには多くの要因があります。細胞継代数ならびに培養培地は、ミリセル24セルカルチャープレートにおける細胞の性状を左右する点に注意してください。細胞継代数が増えることで、タイトジャンクションならびに極在発現の両方に変化をもたらすことがあります。これが最終的に薬剤輸送率の測定にどのように影響するかについては、実験計画において慎重に考慮する必要があります。

    参考文献
    1. Artursson, P., Karlsson, J. (1991) Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelial (Caco-2) cells. Biochem. Biophys. Res. Comm. 175:880–85.
    2. Artursson, P. (1990) Epithelial transport of drugs in cell culture. I: A model for studying the passive diffusion of drugs over intestinal absorptive (Caco-2) cells. J. Pharm. Sci. 79:476–82.
    3. Artursson, P., Palm, K., and Luthman, K. (2001) Caco-2 monolayers in experimental and theoretical predictions of drug transport. Adv. Drug Deliv. Rev. 46:27–43.


  • フルオレセインナトリウム透過性試験
    以下のプロトコールは下記より転載しています：:Tchao, Ruy, Progress in In Vitro Toxicology 6 (2)。フルオレセインナトリウムを使用してミリセルHAセルカルチャーインサートで実施した MDCK細胞単層完全性試験です。この試験は、主に石鹸や洗剤等、水溶性化合物や混合物の刺激性の判定に適しています。これらの結果は、ドレイズ眼刺激性スコアや平均最大ドレイズ（AMD）スコア**と相関があります。この試験は、石鹸や洗剤の刺激のランクを確立するのに使用でき、刺激に関連する化合物を評価・予測することにも使用できる可能性があります。

    混和性の低い素材にはその他の希釈剤で代用します。例えば、ココナッツオイルや鉱油、ジメチル・スルホキシド（DMSO）がお勧めです。コーン油、綿実油、大豆油、鉱油（重鉱油、軽油）はこの試験では悪影響はありませんでした。均質化された鉱油に溶解したドデシル硫酸ナトリウム（ SDS）は、ハンクス平衝塩（HBSS）に溶解した SDSと同様の効果がありました。

    この試験では、in vitro における上皮単層MDCK細胞の細胞間接着の完全性が定量的に決定されます。化合物の透過性の増加は、刺激の増加と関連していることが示されています。未知のサンプルの刺激性は、 SDS陽性コントロールと比較して判断します。このアッセイは、傷害の後の細胞回復率の評価にも使用可能です。例えば、（細胞の剥離や喪失がない場合の）タイトジャンクションの破壊は、完全に回復するまで2～4時間必要です。細胞の剥離や喪失が起きた場合、回復には傷害の重症度によって数日かかることがあります。このアッセイの限界は、使用する希釈のバッファー能のため、極端なpH（pH3未満、またはpH11以上）の化合物を試験に使えないということです。一般的に、こういった極端なpHレベルの化合物は、定義上刺激物と考えられているため試験されません。

    *このセクションはフルオレセインナトリウムのプロトコールを含んでいます。免疫蛍光法ならびにルシファーイエローに関する情報は、ハンドブックの固定と染色のセクションをご覧ください。
    **ドレイズ試験のスコアは、すべて石鹸洗剤工業会から取得したものです。メルクは、ドレイズ眼刺激性試験に関わっていません。

    材料と試薬
    • 24ウェル組織培養プレート（各化合物3プレート）
    • 12mmミリセル HAセルカルチャーインサート、カタログ番号 PIHA 012 50
    • MDCK上皮細胞
    • T-75組織培養フラスコ
    • 10％のウシ胎仔血清ならびゲンタマイシンのMEM培地、1 µg/mL
    • ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）
    • トリプシン-ヴェルセン™
    • フルオレセインナトリウム、1mg/vial

    [Tchao, Ruy, Progress in In Vitro Toxicology 6 (2)より転載]:
    1. T-75培養フラスコで MDCK細胞を MEM培地（10%FBS, 1μg/mLゲンタマイシン）で培養し、トリプシン-ヴェルセン（トリプシン－EDTA）を使用して一週間に一度継代します。
    2. 各ウェル0.5 mL の培地を含む24ウェルプレートにインサートを挿入します。24ウェルプレート1枚で、1種の化合物について6段階の濃度系列を4系列で（n=4）試験できます。
    3. 各インサートに1.5×10⁵の細胞を播種します；3日でコンフルエンスになるはずです。最初に単層の完全性を試験します。この期間、培地は毎日変えてください。
    4. コンフルエントになったら、培地を取り除き、HBSSでインサートを洗い流してください。
    5. 0.5 mL HBSSと特定量の試験化合物を含む新しい24ウェルプレートにインサートを配置します。24°Cで15分間インキュベーションします。
    6. 溶液を静かに注ぎ、毎回1 mL のHBSSを使用して3度洗浄します。
    7. 0.5 mL のHBSSを含む24ウェルウェルプレートにインサートを置きます。0.02%のフルオレセインナトリウムを含む0.5 mL のHBSSをインサートのアピカル側へ加えます。24°Cで30分間インキュベーションします。
    8. インサートを取り除き、光学顕微鏡と電子顕微鏡検査で観察するため固定します。
    9. 各ウェルのフルオレセインナトリウム液を 3mLに希釈し、分光光度計で 490nmを測定します。


  • 観察と顕微鏡観察法


    サンプルの顕微鏡検査は、3つのモードにて実施できます：
    1. プレート下側からの観察（透明なPETまたはCMメンブレン）
      PETまたはCMメンブレンを使用したミリセルデバイスは、倒立顕微鏡を使って下から細胞を観察できる設計となっています。生細胞の観察と、顕微鏡観察は培地を含むレシーバーまたはプラスチックプレートが利用できます。細胞を観察するため、顕微鏡対物（通常5～20倍）は適切な作業距離が必要です。（対物レンズの仕様については、対物レンズ情報のセクションに掲載のウェブサイトをご覧ください。）培地中で観察する必要がない固定細胞は、レシーバープレートを使用せず直接観察することができます。その場合、メンブレン上にある液体（培地、封入液）で対物レンズを汚染させないように注意が必要です。
    2. プレート上側からの観察（ミリセル 6ウェルインサート、ミリセル 24セルカルチャーインサートプレート）
      細胞培養プラットフォームの中には、従来の顕微鏡で低倍率で直接上から細胞を見ることができるものもあります。細胞は、無菌性を維持する場合は蓋を通して観察し、固定済みの細胞や無菌性の維持が不要な場合は蓋を取り除いて観察します。対物レンズの作動距離は、下から測定するときよりも上からのときのほうが長い距離が必要です。免疫蛍光法の場合、光による退色を防ぐため退色防止剤が添加された封入液の使用を推奨します。
    3. スライドガラス上でのメンブレンの観察（高倍率または作動距離が短い［2ｍｍ未満]対物レンズの場合）
      このメンブレンは顕微鏡での観察のために各ウェルから取り除くことができます。これによって高倍率の観察や将来再度観察するためにスライドを保管することが可能です。


    Merck:/Freestyle/BI-Bioscience/Cell-Culture/cell-culture-images/visualizing-cells.bmp

    メンブレンの上側から観察する際は通常、蓋を使用しない場合13.59mm（A）以上、蓋を使用する場合18.03mm（B）以上の作動距離を持つ5～20倍の対物レンズを使用します。メンブレンの下側から観察する場合、作動距離が2mm (C)以上の5～20倍の対物レンズを使用します。

    スライドガラスにメンブレンを乗せる
    1. メンブレンの端に小さな切込みを入れるため、鋭利なメスを使ってウェルからメンブレンを取り除きます。ウェルの直径のおよそ4分の1のウェル壁の内側に沿って慎重に切断します。ピンセットを使いメンブレンを押さえながらメンブレンを取り出すためにウェルの直径に沿って切断します。あるいは、メンブレンの取り除きにはコルクボーラーも使用できます。注：メンブレンが丸まらないように気をつけてください。
    2. スライドガラスの上に細胞を表向きにしてメンブレンディスクを置きます。
    3. メンブレンディスクに50 µLの封入液を添加し、ディスクの下に気泡を作らないように全体を湿らせます。
    4. 気泡を取り除くような角度で、メンブレンの位置までカバーガラスをゆっくりと下げます。


    対物レンズ情報
    顕微鏡の対物レンズの拡大率と作業距離の情報は、個別の光学装置販売店またはメーカーから入手できます。

    注： TEM手順に関する情報は割愛しています。

    材料と試薬
    • ミリセルセルカルチャーインサート
    • リン酸バッファー（PBS）
    • グルタルアルデヒド
    • 四酸化オスミウム
    • カコジル酸ナトリウム
    • しょ糖、試薬用
    • 塩化カルシウム
    • 硝酸鉛
    • クエン酸ナトリウム／水酸化ナトリウム
    • 酢酸ウラニル
    • エタノール
    • 平らな包理トレイ
    • 包理樹脂（EPON812など）
    • 精密ピンセット―カタログ番号 XX66 000 06
    • ダイヤモンドナイフ
    • コルクボーラー
    • デュラポア（ Durapore）フィルターディスク―メルク

    サンプル画像

    Merck:/Freestyle/BI-Bioscience/Cell-Culture/cell-culture-images/murine.bmp

    Olympus IMT-2倒立顕微鏡を使用して1um PETミリセル 24デバイスで観察したマウス胚性幹細胞に由来する生きた胚様体

    Merck:/Freestyle/BI-Bioscience/Cell-Culture/cell-culture-images/neuron.bmp

    ミリセル24 1um PETフィルタープレート上での胚性幹細胞のニューロンへの分化。マウス胚性幹細胞は、浮遊培養系にて胚様体（ EB）を形成させてから付着および分化のために 1 um PETミリセル24プレートへ移しました。写真は、培地中のEBの膜を介して位相差コントラストを示しています。接着した EBのレチノイン酸処理による神経分化がニューロフィラメント免疫蛍光法によって確認されました。

    A. プロセッシング/細胞調製
    注：ステップ1～5は、未処理のミリセルセルカルチャーインサートまたはプレートウェルで実施します。

    1. 固定液を含まないリン酸バッファーを使用して、室温ですばやく（2回各5分）細胞を洗浄します。
    2. 2％のグルタルアルデヒドが入った100 mMのカコジル酸ナトリウム溶液（pH7.5）を用いて、室温で15分～2時間かけて細胞を固定します。
    3. 室温で100 mMのカコジル酸ナトリウム溶液で細胞を洗浄します（2回各5分）。注：この時点で細胞は、4℃、7gシュークロース／100 mLの上記バッファーで保管することができます。
    4. 1％の四酸化オスミウムが入った100 mMのカコジル酸ナトリウム溶液または適切なリン酸バッファーで細胞を固定します。
    5. 次の濃度のエタノールで細胞を脱水します：

      エタノール濃縮キット（％）
      時間（分）
      30 15
      50 15
      70 15
      95 15
      100 3 x 15
       
       
      注：ミリセル‐HAユニットの脱水は、セルロースメンブレンが脱水の過程で脆くなる傾向にあるため、包埋トレイとして使用する金属製の皿の上で行います。これらのステップ途中にメンブレンを移動させようとすると、細胞に物理的ダメージを与える可能性があります。

    6. 透徹には、EDPONの代替品である EPON812や LX112がどちらのデバイスにも適しています（Spurrは使用しないでください）。一般的な透徹の流れはこちらです：

      エタノール濃縮キット（％）トレイ（％プラスチック）
      時間（分）
      75/25 シェーカーで30分
      50/50 シェーカーで30分
      0/100 シェーカーで30分を3回
      0/100 一晩


      注：プロピレンオキシドのような他の薬剤をプラスチックと共に使用する必要はありません。プロピレンオキシドはセルロース性フィルターを溶かします。さらに、これらのステップで使用する検査サンプルの標準的な反転／回転は、（1）細胞層の損傷または（2）セルロース性フィルターを引き伸ばしてしまう可能性があるためお勧めしません。ゲルシェーカー装置にて軽く振れば、透徹がうまくいきます。

      注： 次のステップの前にメンブレンは周りのプラスチックリングから外しておきます。EPONはメンブレンとリングの結合を緩めることがあるので、操作をしなくてもこの現象が起きる場合があります。自然に脱離しない場合、鋭利なメスまたはコルクボーラーを使用してメンブレンを切断します。47mmフィルターサポートディスク上でメンブレンを切断することもできます。いかなる場合も、メンブレンは、重合の間リングに装着したままにしないでください。

    7. 新しいプラスチックに移し、68°Cで一晩重合します。


    B. 切断に関して
    1. ニトロセルロース（HA）、ポリカーボネート（PC）、テレフタル酸ポリエチレン（PET）メンブレン：これらのメンブレンは、どの面でも簡単に切断できます。
    2. CM（バイオポア（Biopore））メンブレン：バイオポアメンブレンは、切断後の最終的な厚みを元に、2つの方法のどちらかで処理します。