In Situ細胞死検出キット、TMRレッド

In Situ細胞死検出キット、TMRレッドは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼビオチン-dUTPニック末端標識（TUNEL）アッセイに使用されています。アポトーシス検出アッセイにも使用されています。

蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーのための赤色蛍光標識による、細胞および組織中の単一細胞レベルでのアポトーシス性のDNA断片化の、正確性、即時性、および簡易性を兼ね備えたシンプルな検出および定量テクニックです。

TUNEL反応は、アポトーシス中に生成されるDNA鎖切断を特異的に標識します。これにより、ネクローシスおよび細胞分裂阻害剤または放射線によって起こる初期のDNA鎖切断から、アポトーシスを区別することができます。

アポトーシスの検出において幅広く使用されている方法には、アガロースゲル電気泳動や、3H-チミジン、または5-ブロモ-2′-デオキシウリジンに基づくDNA断片アッセイによるゲノムDNAの分析が含まれます。これらの方法では、特定の細胞集団において、断片化していない高分子量DNAから、断片化した低分子量DNAを分離します。そのため、これらの方法は、特定の細胞集団または組織切片における個々の細胞の運命に関する情報を提供しません。あるいは、個々細胞は、核のクロマチン濃縮や断片化による特徴的な見た目から、顕微鏡によって区別できますが、この方法は主観的であり、形態学的な変化が最大の場合、タイムウィンドウが比較的狭く限られます。
アポトーシスの証明となるものは、初期段階におけるDNAの分解であり、これはヌクレオソーム間のDNAリンカー領域に選択的です。DNAの分解は、二重鎖および一重鎖（ニック）でのDNA切断物を与えます。両方のタイプの切断は、酵素反応によるフリー3′-OH末端の修飾ヌクレオチド（例、ビオチン-dUTP、DIG-dUTP、フルオレセイン-dUTP）による標識化によって検出できます。酵素末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）は、デオキシヌクレオチドの、一重および二重鎖DNAの3′末端への、テンプレート非依存的な重合化を触媒します。また、この方法は、TUNEL（TdT-mediated dUTP-X nick end labeling）と呼ばれています。また別の方法では、3′-OH基は、ニックトランスレーションと呼ばれるテンプレート依存的なメカニズムによって、DNAポリメラーゼを使用して標識化できます。しかし、TUNEL法が、より高感度で迅速であると考えられています。

サンプル材料：細胞懸濁液、サイトスピンおよび細胞スメア調製物、スライド上の培養接着細胞、冷凍およびパラフィン包埋組織切片。

原理
In Situ細胞死検出キットTMRレッドは、アポトーシスの初期段階で起こる一重および二重鎖DNAの切断を検出します。
アポトーシス細胞は固定化され、透過処理されます。次に細胞はTdTおよびTMR-dUTPを含むTUNEL反応混合物とともにインキュベートされます。このインキュベーション中に、TdTは、一重および二重鎖DNAの3′末端への、TMR-dUTPの付加を触媒します。洗浄後、DNAの損傷部位に取り込まれたラベルは、フローサイトメトリーや蛍光顕微鏡によって検出されます。

フローサイトメトリーや蛍光顕微鏡による、単一細胞レベルでのアポトーシス細胞の検出および定量、およびフルオレセイン標識化細胞マーカーの二重標識（TMRレッド）のためのキットです。

1つのキットには2つのコンポーネントが含まれています。

使用濃度：酵素濃度
最適な酵素濃度範囲は、アッセイあたり0.5～5 Uです。標準的な50 μL PCRでは、2 Uの酵素ブレンドの使用をお勧めします。
使用液：酵素溶液の全量（50 μL）を、残りの450 μLのラベル溶液に加え、500 μLのTUNEL反応混合物を得ます。
成分が均一になるまでよく混合します。
保管条件（使用液）：TUNEL反応混合物は、使用直前に調製し、保存しないでください。TUNEL反応混合物は、使用するまで氷上に置いてください。

TUNEL反応混合物は、使用前に、酵素溶液と標識溶液を混合して調製します。