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SMC^®アッセイのステップごとのガイド

このステップごとのガイドでは、SMC^® Human IL-6 High Sensitivity Immunoassay Kitを例に、1分子カウント（SMC^®）アッセイを実施する方法を開始から終了まで説明します。スタンダードの溶解、標準曲線の作成、ビーズと検出抗体の調製と分注、溶出と中和までの各ステップに関する動画も視聴できます。

スタンダードの溶解方法
標準曲線の作成方法
ビーズの調製・分注方法
検出抗体の調製・分注方法
溶出・中和ステップの実施方法
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スタンダードの溶解方法

以下に、SMC^® IL-6アッセイのスタンダードを溶解するための手順を示します。

ホイルとシールをはがし、ゴム栓をゆるめます
このゴム栓はバイアルから外さないように注意してください
IL-6凍結乾燥スタンダードを250 µLの超純水で溶解します
数回バイアルを転倒混和します
バイアルを5～10分間静置します

これらのステップをまとめた動画も視聴できます。

標準曲線の作成方法

以下に、SMC^® IL-6アッセイの標準曲線を作成する手順の概要を示します。

Standard Diluentの分注

12チャネルリザーバーのウェル2～5に、Standard Diluentを1,000 µLずつ添加します
次に、ウェル6～12にStandard Diluent を500 µLずつ添加します

標準曲線用の連続希釈液の調製

IL-6スタンダードバイアルの開始濃度については、分析証明書の基準値を参照してください
IL-6スタンダードストックを50 pg/mLになるように、少なくとも1 mLの最終溶量で希釈します
50 pg/mLのスタンダードストック1 mLを12チャンネルリザーバーのウェル1に添加します
ウェル1から500 µLをウェル2に移し、十分に混合します
連続希釈をウェル2からウェル11まで行い、都度十分にむらなく混合します
ウェル12には何も添加せず混合します

サンプルおよびスタンダードのアッセイプレートへの分注

各スタンダード75 µLをアッセイプレートの対応するウェルにピペットで添加します
サンプル75 µLをアッセイプレートの対応するウェルにピペットで添加します

以上の各ステップの操作はこの動画でも確認できます。

ビーズの調製・分注方法

以下に、SMC^® IL-6アッセイのビーズの調製と分注の手順を示します。

キャプチャ抗体ビーズの調製

IL-6キャプチャ抗体ビーズを、ローテーター（rotisserie-style mixer）で、すべてのビーズが懸濁するまで混合します（推奨時間は30分以上）
次に、ビーズバイアルの全量を11.0 mLのAssay Bufferに添加します
ビーズバイアルを0.55 mLのAssay Bufferでリンスして加え、すべてのビーズを回収します
穏やかに転倒混和します
アッセイプレートに分注するため、ビーズをリザーバーへ分注します

キャプチャ抗体ビーズのアッセイプレートへの分注

希釈したビーズをアッセイプレートに1ウェルあたり100 µLずつピペットで分注します
各分注操作の間にピペットを用いてビーズを再懸濁します

キャプチャインキュベーション

アッセイプレートを透明な粘着プレートシールを用いてシールします
シールをしっかり押さえて密閉し、漏れや交差汚染を防ぎます
マイクロプレートインキュベーター／シェーカーにおいて25℃で2時間インキュベートします
- 推奨のBoekel Scientific Jitterbug™ Heatedマイクロプレートシェーカー（VWRカタログ番号：35821-065）：
  - プレートを推奨のJitterbug™ Heatedマイクロプレートシェーカーにセットします
  - 「Mix 5」をクリックします
  - 攪拌は25℃で2時間行います

この動画で各ステップを確認できます。

検出抗体の調製・分注方法

以下に、SMC^® IL-6アッセイの検出抗体の調製と分注の手順を示します。

BioTek^™ 405™ TSUVSプレートウォッシャー（カタログ番号：95-0004-05）：
- プレートをマニホールド上にセットします
- 洗浄プログラムの「Post Capture Wash」を選択します
- 「Run」をクリックします

検出抗体の調製方法

1x検出抗体の調製： 250 µLの20S検出抗体を4,750 µLのAssay Bufferに添加します
希釈液を転倒混和します
0.2 µmフィルター付きシリンジで希釈した検出抗体をろ過し、リザーバーに入れます

検出抗体をアッセイプレートに分注します

プレートウォッシャーからプレートを取り外した後、検出抗体を1ウェルあたり20 µLずつ分注します
アッセイプレートを透明な粘着プレートシールでしっかりとシールします
マイクロプレートインキュベーター／シェーカーで25℃で1時間インキュベートします
- 推奨のBoekel Scientific Jitterbug™ Heatedマイクロプレートシェーカー（VWRカタログ番号：35821-065）：
  - プレートを推奨のJitterbug™ Heatedマイクロプレートシェーカーにセットします
  - 「Mix 5」をクリックします
  - 攪拌は25℃で1時間行います

検出抗体の調製および分注方法はこの動画をご覧ください。

溶出・中和ステップの実施方法

以下に、SMC^® IL-6アッセイの溶出と中和の手順を示します。

検出洗浄1

BioTek^™ 405™ TSUVSプレートウォッシャー（カタログ番号：95-0004-05）：
- プレートをマニホールド上にセットします
- 洗浄プログラム「4 Cycle Pre-Transfer」を選択します
- 「Run」をクリックします

検出洗浄インキュベーション後

推奨のBoekel Scientific Jitterbug™ Heatedマイクロプレートシェーカー（VWRカタログ番号：35821-065）：
- 4CyPrTr洗浄後、プレートを推奨のJitterbug™ Heatedマイクロプレートシェーカーにセットします
- 「Mix 3」をクリックします
- 攪拌は25℃で1～5分間行います

検出洗浄2

BioTek^™ 405™ TSUVSプレートウォッシャー（カタログ番号：95-0004-05）：
- プレートをマニホールド上に再びセットします
- 洗浄プログラム「Final aspiration」を選択します
- 「Run」をクリックします

Buffer Bの分注

プレートウォッシャーからプレートを取り外した後、Buffer Bを1ウェルあたり11 µLずつ分注します
アッセイプレートを透明な粘着プレートシールを用いてシールします

溶出インキュベーション

推奨のBoekel Scientific Jitterbug™ Heatedマイクロプレートシェーカー（VWRカタログ番号：35821-065）：
- プレートを推奨のJitterbug™ Heatedマイクロプレートシェーカーにセットします
- 「Mix 5」をクリックします
- 攪拌は25℃で10分間行います

Buffer Dの分注

新しい96ウェルアッセイプレートにBuffer Dを1ウェルあたり11 µL添加します
アッセイプレートを透明な粘着プレートシールを用いてシールします

2枚目の96ウェルプレートに溶出液を分注

アッセイプレートをSMC^®マグネット上にセットします
室温で2分間静置して、ビーズが沈降し、ペレットを形成できるようにします
ウェルの端に赤い点のように見えるビーズペレットが形成されます
アッセイプレートの溶出液10 µLをプレートのV底から直接吸引して、先の手順でBuffer Dを添加した96ウェルプレートに移します
ビーズペレットには触れないようにします
操作ごとにチップを交換してください

最終攪拌ステップ

推奨のBoekel Scientific Jitterbug™ Heatedマイクロプレートシェーカー（VWRカタログ番号：35821-065）：
- SMC^® 384ウェル読み取りプレートを黒色の蓋で底をカバーしたまま推奨のJitterbug™ Heatedマイクロプレートシェーカーにセットします
- 「Mix 5」をクリックします
- 攪拌は2分間行います
- プレートを1,100 xgで1分間遠心分離します

384ウェルプレートに中和溶出液を分注します

384ウェルプレートのQuadrantの使用手順を確認します
1ウェルあたり中和溶出液20 µLをSMCxPRO^® 読み取りプレートの対応するウェルにピペットで添加します。

プレート読み取り前

読み取りプレートを透明な粘着プレートシールでシールします
プレートを約1,100 xgで室温で1分間遠心分離します
プレートシールをはがし、読み取りプレートのウェルを確認し、気泡がある場合は除去します

プレートの読み取り

アルミニウムホイルシールでプレートをシールします
- シールはしっかりと行ってください
- プレートから底をカバーしていた黒色の蓋を外します
プレートをSMCxPRO^®システムにセットし、読み取ります

SMC^®プロトコルの主な溶出および中和ステップについては、この動画をご覧ください。

SMC®アッセイのステップごとのガイド