ホーム2D材料の重要性：バイオセンシング用途の展望

2D材料の重要性：バイオセンシング用途の展望

Chengye Dong^1,3,5,**, Derrick Butler^2,3,4,**, Rui Zhao, Yonghong Cheng⁵, Joshua A. Robinson^1,3,4*, Aida Ebrahimi^2,3,4*

¹Department of Materials Science and Engineering, The Pennsylvania State University, University Park, PA 16802, USA, ²School of Electrical Engineering and Computer Science, The Pennsylvania State University, University Park, PA 16802, USA, ³Materials Research Institute, The Pennsylvania State University, University Park, PA 16802, USA, ⁴Center for Atomically Thin Multifunctional Coatings, The Pennsylvania State University, University Park, PA 16802, USA, ⁵State Key Lab of Electrical Insulation and Power Equipment, Xi’an Jiaotong University, Xi’an, Shaanxi 710049, People’s Republic of China

Material Matters 2019, Vol.14 No.1

* E-mail: sue66@engr.psu.edu and jrobinson@psu.edu
** These authors contributed equally.

・はじめに
・バイオセンシング用2D材料の合成
・バイオセンシング用途に向けた2D材料
・結論および展望

はじめに

グラフェンが2004年に単離されて以降、並外れた電気伝導率、大きい比表面積（体積あたりの表面積）、特有の光学／振動モード、非常に高い機械的強度および優れた生体適合性を示すことから、生化学センシング用途におけるグラフェンの使用に対する関心がますます高まっています^1-4。さらに、グラフェン表面の特定の欠陥や化学的官能基は、触媒作用や電気化学バイオセンシングのための優れた反応部位となります⁵。さまざまなバイオセンシング技術でグラフェンの応用が成功したことで、遷移金属ダイカルコゲナイド（TMD：transition metal dichalcogenide)、遷移金属酸化物（TMO：transition metal oxide）、遷移金属炭化物／窒化物（MXene：transition metal carbides/nitrides）、六方晶窒化ホウ素（hBN：hexagonal boron nitride）をはじめとするその他グラフェン様材料のバイオセンシング用途の研究が進められています^6,7。2D材料は、多様な組成、構造および機能性を持つため、新たな生化学センサの開発に非常に適しています。さらに、積層、ドーピング、修飾および合金化による2D材料の制御における最近の進展は、より複雑な構造の構築も可能にしています。

本ミニレビューでは、バイオセンシング用途での関連性に重点を置いて2D材料の合成および調製における最近の進展を紹介した後、2D材料を使用したバイオセンサとして最も研究されている電気化学および光学バイオセンサについて概説します（図1）。

さらに、2D材料のバイオセンシング技術としては、これまであまり研究されていない技術についても議論し、
最後に生物医学的分析ツールとしての2D材料の将来や研究の方向性について述べます。

図1電気化学バイオセンサ（電流測定法、電位差測定法およびインピーダンス測定法）と光学バイオセンサ（FRET：Förster共鳴エネルギー移動、SERS：表面増強ラマン分光法およびSPR：表面プラズモン共鳴）の用途に向けた2D材料のさまざまな合成法（剥離法、化学気相成長法（CVD）、電気化学的堆積法および液相合成法）の概要

バイオセンシング用2D材料の合成

一般に、バイオセンサで使用される2D材料の調製法は、機械的および化学的な剥離法、電着法、化学気相成長法（CVD：chemical-vapor deposition）、ならびに液相合成法に分類されます。本セクションでは、2D薄片、粉体、インクおよび膜を作製する2D層の合成法（図2）に焦点を合わせます。

剥離法

機械的剥離法（またはマイクロメカニカル劈開（MC：micromechanical cleavage）、図2A）は、バルク層状構造からの2D材料調製法として最も報告されている方法です¹。MCで調製した2D薄片は他の方法で調製したものより高品質であるものの、実験スキルに強く依存し、低収率のため、大規模なデバイス製造法としての実用性は限定的です。これに対して、化学的剥離法（図2B）は2D薄片の大規模合成に適した方法です⁸。Liインターカレーションおよび剥離法は、MoS₂、TaS₂、TiS₂、WS₂、ZrS₂、NbSe₂、Wse2₂、SbSe₃、Bi₂Te₃およびhBNを調製する際に薄片の厚さの制御と剥離の収率を改善するために開発された方法です⁸。化学的剥離法は高収率および高効率で2D薄片を作製できる方法ですが、剥離の際の2D表面の変化により欠陥や不純物が導入される場合があり、共存している単層と多層の薄片を分離することも困難です。

化学気相成長法（CVD）

CVD（図2C）は、高品質および大面積2D材料の合成法として一般的に使用されている方法です。CVDの場合、高温の炉内に導入された炭素系前駆体が反応および／または分解して、Si/SiO₂、遷移金属触媒（Cu、Ni）、またはサファイアなどの基板上に炭素を堆積し、単層または多層の2D材料を形成させます。2D材料の品質、大きさおよび厚さは、温度、圧力および基板の状態などの実験パラメータで調節することが可能です。例えば、この方法で伝導性基板上にセンチメートルスケールで単層または数層のグラフェンを調製し、デバイス製造のため絶縁基板上に転写されています⁹。さらに、触媒を使用せずにサファイア（誘電体基板）上にCVDグラフェンを合成することで、転写過程による損傷の可能性を排除し、直接成長させたグラフェン上にデバイスを製造することが可能になっています¹⁰。

図22D材料の合成法。A）粘着テープを使用した2D材料の機械的剥離法。B)層状バルク材料から2Dナノシートを製造するための電気化学的リチウム挿入過程。文献8より許可を得て転載。copyright 2011 Wiley-VCH。C）2D薄膜を製造するためのCVDの略図。D)還元型酸化グラフェン（rGO）の電着過程。文献12より許可を得て転載。copyright 2018 Beilstein-Institute。E）2H-および1T-WS2の液相合成。文献15より許可を得て転載。copyright 2014 American Chemical Society。

電気化学的堆積法

電気化学的堆積法（図2D）は、ナノ材料の薄膜を低温で調製するための費用効率が高い代替方法です。膜の形状、厚さおよび特性は、印加する電流、電圧および堆積時間を調節することで制御可能です。グラフェン膜やrGO膜は、バイオセンシング用途のさまざまな作用極に電気化学的に堆積されており、後に本稿でもその一部の例について議論しています^11,12。これらの膜は2Dナノシートの分散液から調製されるので、信号を増強してセンサ感度を向上させるために他のナノ粒子により多数の端面を持つ膜を構築することが可能です¹³。ただし、水性環境および制御不能な堆積過程であるため、高品質および再現性を得ることは大きな課題として残されています。

液相合成法

最後に、液相合成法（図2E）では、比較的温和な条件および低温で精密な厚さのグラムスケール量の2D材料を製造することが可能ですまた、水性または非加水分解性の媒質のどちらかで2D材料を修飾することも可能です。最近、厚さと形状を制御した2D材料を高収率および大規模で調製するための、グラフェン¹⁴、TMD（MoS₂、MoSe₂、WS₂およびWSe₂など）¹⁵およびMXene¹⁶の溶液系の合成法が開発されています。さらに、液相合成法では、1T′ MoTe₂ ¹⁷などの他の方法では作製が困難な2D材料の特定の相を直接調製することも可能です。

バイオセンシング用途に向けた2D材料

神経伝達物質（ドーパミン、セロトニンなど）、代謝物（グルコース、ラクトース、アスコルビン酸、アデノシンなど）、炎症マーカー（過酸化水素や酸化窒素などの活性酸素種および活性窒素種）、タンパク質、核酸、バクテリア細胞および重金属を検出するための2D材料に基づくバイオセンサの使用に関する報告が急増しています。以下、さまざまな生物学的標的の電気化学的検出（電流測定、インピーダンス測定、電界効果トランジスタ（FET：field-effect transistor）を含む電位差測定）^18-21および光学的検出（FRET²²、SPR²³およびSERS²⁴など）のための、2D材料を使用した最近のバイオセンサに関する報告の一部をまとめます。

電気化学センサ

その他の技術と比較して、電気化学センサは集積回路（IC：integrated circuit）技術との適合性があるため、高感度で応答が速く、費用効率に優れ、読取りが単純であることから、特にポイントオブケア（臨床現場即時性）の点で生化学センシング用途において好まれる場合が多くなっています。電気化学センサの開発において、2D材料は実際のセンシング素子（作用電極またはチャネル材料）としての役割や、金属ナノ構造、金属酸化物ナノ構造、もしくはカーボンナノ構造、生体酵素、もしくはその他の機能性2D材料でさらに修飾するための基板としての役割を果たすことが可能です。電気化学センサの多くは電流測定による検出（特定の電位を作用電極に印加したときの電流変化）に基づいていますが、電位差測定による検出（表面電位の変化）またはインピーダンス分光法（印加周波数の関数としてのインピーダンス変調）を利用する電気化学センサもあります。

電流測定（またはボルタンメトリー）による検出は、サイクリックボルタンメトリー（CV：cyclic voltammetry）、リニアスイープボルタンメトリー（LSV：linear sweep voltammetry）、微分パルスボルタンメトリー（DPV：differential pulse voltammetry）、クロノアンペロメトリーなどのさまざまな方法に基づくものがあります。Sunら¹⁸は、リン酸緩衝食塩水（PBS：phosphate buffered saline）中のドーパミン（DA：dopamine）、アスコルビン酸（AA：ascorbic acid）および尿酸（UA：uric acid）の同時検出にナノ複合材料電極とDPVを使用しました。使用されたセンサは、Liインターカレーションにより合成されたMoS₂ナノシートと電着させたAuナノ粒子を組み合わせたナノ複合材料をガラス状炭素電極（GCE：glassy carbon electrode）上に堆積したものです。この方法で作製されたセンサでは、AA、DAおよびUAの検出限界がそれぞれ50 μM、50 nMおよび50 μM、比例領域がそれぞれ0.05～100 mM、0.05～30 μMおよび0.05～40 mMを達成しています。我々のグループでは、グラフェンと硫化鉄のヘテロ構造を用い、過酸化水素の約0.1 nMの低濃度まで6桁を超える濃度範囲で高感度かつ選択的なボルタンメトリー検出が可能です²⁵。グラフェンの作製法に依存して応答が大幅に異なることが示されています（FeS／CVDグラフェンのヘテロ構造はFeS／(n型および／p型のエピタキシャルグラフェン)／6H-SiC(0001)を上回る性能を示しました。6H-SiC(0001)を加熱するとn型グラフェンに、これを水素中で加熱するとp型グラフェンになります）。E. coli細胞において熱ショックにより誘起された酸化ストレスがin situで観測できることが明確に示されています²⁵。電流測定によるグルコース検出について、Rakhiら¹⁹はMXene Ti₃C₂T_xナノシートとAuナノ粒子を組み合わせて固定化グルコースオキシダーゼ（GOx）とのナノ複合材料を形成させ、さらにナフィオンで被覆しました。このセンサでは、PBS（pH = 7）中で最低5.9 μMのグルコースが検出可能で、比例領域は0.1～18 mMでした（図3A）。臨床検査での血糖値（約5 mM）がこの範囲内に入るため、実世界の用途でも実現可能なセンサとなります。このセンサは2か月間の保管後に（3 mMで）93%の応答性を維持しており、堅牢性と長期安定性が示されています。

電位差測定バイオセンサは主にFETを使用したセンサで、さまざまな被験物質を検出できることから注目を集めています。Zhangら²⁰により、CVD成長グラフェンをゲートとチャネルの双方に使用した、PBS中のグルコースを検出する溶液ゲート電位差測定センサが開発されています。ゲート電極はPtナノ粒子とGOxで修飾されており、グルコースの酸化に触媒作用を及ぼしてH₂O₂を生成させます。次にH₂O₂が酸化され、実質的にゲート電圧を変化させます。このセンサをグルコース濃度の決定に間接的に使用した場合（図3B）、グルコースの検出限界は500 nMとなり、唾液や汗などの試料中で非侵襲的な検出には十分低い検出限界が得られています。インピーダンス測定センサは、標的被験物質が存在する場合または存在しない場合に、ファラデーインピーダンスと非ファラデーインピーダンスのどちらかの変化を利用するセンサです。Jiaら²¹はサルモネラのファラデー検出のため、rGO／多層カーボンナノチューブ（MWCNT）の複合材料を開発し、GCE上に電着しました。電極を調製した後、アミノ修飾したサルモネラアプタマーを電極にドロップキャストしました。電荷移動抵抗の変化に基づき、前処理なしの60分間で、1ミリリットルあたり25コロニー形成単位（cfu）という少数を検出することが可能で、比例範囲は75～7.5×10⁵ cfu/mlでした（図3C）。腸チフスを引き起こすサルモネラの場合、感染量は細胞1,000個という少数の場合があるため、このセンサは臨床現場適用できる可能性があります²⁶。

図3電流測定、電位差測定およびインピーダンスに変換するメカニズムを利用した電気化学センサの例。A）Rakhiら¹⁹が開発したMXene/Auナノ粒子/ナフィオン/GOx複合材料にグルコースオキシダーゼ（GOx）を付加した時のグルコースに対するピーク電流応答の増強。挿入図は、Auナノ粒子で被覆されたMXene層の走査型電子顕微鏡（SEM）像（スケールバーは2 μm）。B）グラフェンをゲートとチャネルの双方に使用した、グルコースの間接検出用の電位差測定センサ。GOxおよびPtナノ粒子でゲート電極が修飾されており、グルコースとの反応でH₂O₂が生成します。H₂O₂が酸化されると実質的なゲート電位の変化が生じ、グルコース濃度の決定に使用されます²⁰。C）Jiaらはサルモネラのファラデーインピーダンス検出のため、アプタマーで修飾したGCE上のrGO/MWCNT複合材料を使用しました。ナイキスト線図（-Z_im　対 Z_re）の半円の直径は、対応する回路モデルで見られる電荷移動抵抗を定性的に示します。文献19および20より許可を得て転載。それぞれcopyright 2016および2015 Nature Publishing Group。

光学センサ

2D材料は電子および電気化学特性が調節可能なだけでなく、フォトルミネッセンス、蛍光消光、二次高調波発生および電子-フォトン相互作用増強などの独特な光学および振動特性をもっており、光学センサでの使用に最適の材料です^22-24。一般的な光学式センシング法として、Förster共鳴エネルギー移動（FRET）²²、表面プラズモン共鳴（SPR）²³および表面増強ラマン分光法（SERS）²⁴などがあります。FRETなどの蛍光消光または増強に基づくセンサは、標的被験物質の存在／非存在下での蛍光の変化を検出します。Kongらは、前立腺がんの重要なマーカーである前立腺特異抗原（PSA：prostate specific antigen）を検出するためのセンサを作製しました²²。このセンサはLiインターカレーションMoS₂ナノシートを使用しており、蛍光修飾した一本鎖（ss）DNAプローブが表面に吸着しています（図4A）。PSAが存在しない場合、蛍光は強く消光されますが、PSAの添加により蛍光が回復しました。ダイナミック応答範囲は0.5～300 ng/mlで、比例領域は0.5～60 ng/mlと報告されています。検出限界は0.2 ng/mlで、がん胎児性抗原（CEA：carcinoembryonic antigen）などの一般的な他の干渉タンパク質が存在する状況でこの方法は選択性を示しました。PSA値は4 ng/ml以上で前立腺がんの可能性を示唆するため、実用的な意味があることは明らかです。

SPRセンサは、標的の被験物質の存在下または非存在下での局所的な屈折率の変化を検出します。表面プラズモンはこれらの変化に対して高感度を示します。2D材料は薄膜状であることからSPRセンサに非常に良く統合されるため、SPRセンサの感度増強に使用されています。

図4A）所定濃度のPSAアプタマー（50 nM）に対してMoS₂ナノシート（0～40 μg/ml）をより多く添加すると蛍光強度が減少します。PSA濃度が増加すると蛍光が回復します（ここでは0～300 ng/mlを示しています）。文献22より許可を得て転載。copyright 2015 Springer。B）Kamaruddinらが使用したSPR測定の実験装置の構成。Hg²⁺およびPb²⁺イオンの検出にキトサン-GO複合材料が使用されています。MDPIのオープンアクセス方針の下、文献23より許可を得て転載。C）Auナノ粒子／WS₂ナノシートは、SERSを用いたミオグロビン（Mb：myoglobin）検出用のアプタマーを修飾するための基板としての役割を果たします。ラマンピーク強度の変化からMb濃度を決定することが可能です。文献24より許可を得て転載。copyright 2018 Springer。

Kamaruddinら²³は、重金属イオンのPb²⁺およびHg²⁺の検出のため、キトサンと酸化グラフェンを組み合わせ、Au/Ag/Au層状基板上に堆積しました。クレッチマン配置（図4B）を使用することで、両イオンについて1 ppm未満を検出することが可能で、両方の比例領域においてPb²⁺ イオンに対する感度がHg²⁺イオンに対する感度よりわずかに高くなりました（Pb²⁺およびHg²⁺について、それぞれ2.05および0.29 ppm -1 対 1.66および0.20 ppm -1）。

蛍光に基づく方法やSPR法の他に、SERSでは被験物質の表面吸着によるラマン散乱の微小変化を検出します。Shorieら²⁴はミオグロビン（Mb）の検出のため、液相剥離WS₂ナノシートとAuナノ粒子を組み合わせたSERS系センサを作製しました（図4C）。Mbレベルの上昇は筋肉の損傷を示唆しており、心臓発作の早期発見に使用することが可能です。このセンサでは、Mbを選択的に検出するために抗Mbアプタマーを表面に堆積することで、心臓発作やその他の筋肉損傷を示唆する血中濃度（約85 ng/ml）より十分に低い10^-2 pg/mlを検出することができました。WS₂／Auナノ粒子による増強因子は6.78　×　10⁶でした。

結論および展望

本稿では、2D材料の合成における最近の進展について、バイオセンシング技術への応用を中心にまとめました。バイオセンシングプラットフォームとしての2D材料の合成に使用されるさまざまな方法の利点と欠点を議論しました。2D材料ならではの特性のため、新奇な電気化学センサおよび光学式センサで神経伝達物質、代謝物、タンパク質、核酸、バクテリア細胞および重金属を検出することが可能です。

2D材料による感度増強、原子レベルの薄い形状および高度な修飾能力を考慮すると、この種類の材料から医療、特にポイントオブケア診断や柔軟および／または体内で消滅するバイオエレクトロニクスにおいて、新しい手段が開発される可能性があります。ただし、その能力を完全に発揮させるためには、さらなる技術開発および特性の理解が必要です。第一に、より低いコストおよび材料や形状のより高い制御性で、使用環境において安定な2D材料およびヘテロ構造を開発するための合成法があれば、バイオセンシング用途、特にフレキシブルプラットフォームとの適合性が改善されます。第二に、2D材料のセンシング性能に影響を及ぼす層数、欠陥の化学的性質および物質相の制御を確立することが必要です。第三に、光学／電子／振動特性に著しい影響を与える2D材料表面の修飾の制御はまだ十分に調べられておらず、新しい研究領域です。最後に、異なる2D材料（グラフェン、GO、rGOおよびMoS₂以外）の生体適合性および／または抗菌性や、この合成法による影響を体系的に調査する必要があります。