밀리셀® 마이크로웰 플레이트를 이용한 오가노이드 생성 및 표현형 스크리닝
생물의학 연구 분야에서 점점 더 널리 사용되는 도구인 오가노이드는 체외에서 재현 가능한 3차원 소형 장기 모델이다. 오가노이드는 암 연구, 항암제 개발, 맞춤형 의학 개발과 같은 응용 분야에 유망한 모델이다.
기존 오가노이드는 고형화된 세포외 기질(ECM) 내에서 배양되는데, 이는 종종 재현성이 떨어집니다. 형성된 오가노이드는 크기와 형태가 불균일할 수 있으며 하이드로겔 내 여러 위치와 초점 평면에 무작위로 배치될 수 있습니다. Millicell® Microwell 96-웰 플레이트는 기존 오가노이드 배양에서 발견되는 일부 문제를 표준화하고 극복합니다.
섹션 개요
그림 1.전통적인 오가노이드 배양(왼쪽) 대 Millicell® 마이크로웰 96-웰 플레이트에서의 오가노이드 배양(오른쪽).
Millicell® 마이크로웰 96-웰 플레이트 특성
Millicell® 마이크로웰 플레이트는 고처리량, 확장 가능하고 신뢰할 수 있는 오가노이드 배양을 위한 즉시 사용 가능한 플랫폼입니다. 이 플레이트는 웰 내에 비접착성 마이크로웰을 포함하여 균일한 오가노이드 수율을 높입니다. 밀리셀® 마이크로웰 플레이트는 외부 고체 ECM이 거의 또는 전혀 필요하지 않으며, 각 마이크로웰에는 독특한 수성 폴리에틸렌글라이콜(PEG) 하이드로겔이 포함되어 있습니다. 이 PEG 하이드로겔은 웰 내 세포 시딩 및 분석법 개발을 가능하게 하며, 플레이트 내 이미징 시 회절 현상을 줄여줍니다.
그림 2.체외 3차원 오가노이드 스크리닝 방법의 개략적 표현. 왼쪽부터 마트리젤®, 비접착성 표면, 밀리셀® 마이크로웰 플레이트.
다양한 마이크로웰 크기에 대한 머크의 표준 설계는 Millicell® 마이크로웰 96-웰 플레이트를 사용하여 오가노이드 생성을 확장할 수 있도록 합니다.
그림 3.각 마이크로웰 크기에 대한 마이크로웰/웰의 개략도.
밀리셀® 마이크로웰 플레이트를 이용한 마우스 장 오가노이드 배양 및 특성 분석
최초로 보고된 오가노이드 중 하나인 마우스 장 오가노이드는 암 치료법, 면역학, 미생물군집 연구를 수행하는 연구자들에게 널리 사용되는 모델입니다. 머크는 마우스 장 오가노이드의 배양 및 특성 분석을 위해 Millicell® 마이크로웰 400μm 96-웰 플레이트를 사용했습니다.
배양 배지 접종, 성장 및 이미징 전 과정을 모니터링한 결과, 한 웰에서 시간 경과에 따라 121개의 단일 오가노이드가 형성되었습니다. 이들 오가노이드는 균일한 크기를 보였으며 마이크로웰 내에 국한되어 이미징을 용이하게 했습니다. 마우스 장 오가노이드는 분화 후 전형적인 분열 형태를 보였으며, 분화된 장 세포들은 특이적인 장 표지자를 발현했습니다.
그림 4.Millicell® 마이크로웰 플레이트에서 배양된 마우스 장 장기유사체. A) 접종 후 1시간, B) 10시간, C) 2시간, D) 3일, E) 4일 경과 시점.
밀리셀® 마이크로웰 96-웰 플레이트에서 시간 경과에 따른 이미징을 통해 오가노이드의 면적을 정량화하였다. 오가노이드는 특정 미세 공동에 국한되었으며, 성장 초기 1~3일 동안 균일한 크기를 유지하다가 오가노이드가 분열을 시작하면서 크기가 확대되었다.
그림 5.Millicell® 마이크로웰 플레이트에서 배양된 마우스 장 오가노이드의 대표적인 예시: A) 3일차; B) 5일차; C) 8일차.
장 오가노이드는 이러한 장 오가노이드에 전형적인 분화 현상을 보였으며, 장내분비세포, 장상피세포, 파네트세포 및 잔세포를 포함한 분화된 세포를 함유하고 있었다. 유리 이미징 슬라이드에서 면역형광법을 통해 특정 표지자와 상피 극성을 관찰하였다(그림 6).
그림 6.마이크로웰 어세이에서 배양된 오가노이드 내 점액세포(Goblet cell)의 존재를 강조하는 뮤신-2(Mucin-2) 단백질 발현
밀리셀® 마이크로웰 플레이트를 이용한 오가노이드 생성은 확장 가능하며 유사한 크기와 형태의 오가노이드를 생성했습니다.
밀리셀® 마이크로웰 플레이트를 이용한 대장암 오가노이드 표현형 스크리닝
머크는 Millicell® 마이크로웰 96-웰 플레이트를 사용하여 HCT-116 스페로이드 및 환자 유래 대장암(CRC) 오가노이드에 대해 80종의 항암 화합물에 대한 자동화된 약물 스크리닝을 수행했습니다. 균질한 미세 조직의 치료 반응은 고내용 이미징 표현형 스크리닝을 통해 평가되었으며, 250개 이상의 표현형 지표가 추출되었습니다.
밀리셀® 마이크로웰 96-웰 플레이트에서 배양된 오가노이드의 표현형을 분석할 때, 아푸레세르티브 투여 중 이전에 관찰되지 않았던 표현형이 드러났습니다. 본 연구에서는 밀리셀® 마이크로웰 96-웰 플레이트가 완전 자동화, 고처리량 스크린에서 단일 오가노이드 수준에서 약물 및 기타 화합물의 효과를 평가하는 데 사용될 수 있음을 입증합니다.
그림 6.CRC 오가노이드 약물 스크리닝 워크플로우. A) Millicell® Microwell 96-well 플레이트에서 CRC 오가노이드 및 HCT-116 스페로이드 화합물 스크리닝 프로토콜, B) 자동화(하이드로겔 평형, 세포 시딩, 배지 교체 및 약물 노출, 분석) 대 수동(오가노이드 분해) 오가노이드 생성 과정 개요도, C) 수동 및 자동 오가노이드 생성 시 콜로니가 형성된 웰의 비율 정량화.
화합물 노출 후 오가노이드의 생존율을 평가하고 고내용 이미징 분석을 통해 표현형을 모니터링하였다. 웰당 분할된 40개의 오가노이드 각각에서 250개 이상의 측정값을 추출하였으며, 양성 및 음성 대조군을 통해 약물의 효능을 확인하였다. 이 스크리닝은 높은 재현성을 보였으며, 스페로이드의 R² 값은 0.9, 오가노이드의 R² 값은 0.79였다.
대장암 오가노이드에 대한 아푸레세르티브 심층 분석
아푸레세르티브는 세린/트레오닌 단백질 키나아제 Akt(단백질 키나아제 B)의 억제제이다. Akt 억제를 통해 종양 세포 증식을 억제하고 종양 세포 사멸을 유도할 수 있다. 본 연구에 사용된 80개 화합물 분석 결과, 아푸레세르티브 노출은 HCT-116 스페로이드가 아닌 CRC 오가노이드에서 주요 팽창을 포함한 강한 표현형을 독성 농도 미만에서 유발했다. 이는 전통적인 생존율 분석에서는 흔히 모니터링되지 않는 표현형이지만, Millicell® Microwell 96-웰 플레이트를 사용하면 쉽게 관찰할 수 있습니다.
그림 7.아푸레세르티브의 CRC 오가노이드 스크리닝. A) 다양한 아푸레세르티브 농도에서 오가노이드 크기를 보여주는 광시야 및 형광 이미지, B) 미세조직 면적 기준 증가하는 아푸레세르티브 농도에 대한 오가노이드 표현형 반응 (IC50=0.31μM), C) 증가하는 아푸레세르티브 농도에서의 오가노이드 생존율 (IC50=10.67μM). 감보산: GA.
CRC 오가노이드 표현형 스크리닝 요약
Millicell® 마이크로웰 플레이트에서 CRC 오가노이드 및 HCT-116 스페로이드의 생성(시딩부터 이미징 판독까지)은 자동 액체 처리 시스템 및 고처리량 스크리닝 응용 분야와 호환되었습니다. 밀리셀® 마이크로웰 플레이트는 웰당 70개 이상의 오가노이드 생성 시에도 집단 기반 판독 대신 단일 오가노이드 분석을 가능하게 했습니다. 이 특성은 연구자들이 그렇지 않으면 발견되지 않을 형질들을 발견하는 데 도움을 줍니다.
Millicell® 마이크로웰 플레이트에서 생성된 환자 유래 오가노이드는 해당 종양을 매우 유사하게 모델링하는 것으로 확인되었으며, 연구자들이 화학요법에 대한 환자별 반응을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.