세포 배양 오염 문제 해결 방법
8월 12일 시험
세포 배양 오염: 개요
일반적으로 “세포 배양 오염”이라고 하면 세포 사이로 번식하는 박테리아나 탁해진 배양액을 떠올리기 마련이지만, 배양 플라스크에 침입하는 원치 않는 이물질은 다양한 형태를 띨 수 있습니다. 바이러스 및 화학적 오염 물질 또한 배양 상태의 건강에 상당한 영향을 미칠 수 있으며, 세포주 간의 교차 오염을 방지하는 것은 결과의 재현성을 확보하는 데 매우 중요합니다.
세포 오염은 얼마나 만연해 있을까요? FDA, ATCC 및 기타 기관의 연구에 따르면, 오늘날 전체 세포 배양 중 5~30%가 마이코플라스마 종만으로 오염된 것으로 추정됩니다. 한 연구에5 따르면 일반적인 세포주에서 바이러스 오염 발생률은 25%를 초과했으며, 비세포병성 바이러스는 배양 상태만으로는 그 존재를 파악하기 어려워 마이코플라스마보다 탐지되지 않을 가능성이 훨씬 더 높습니다.
그림 1.세포 오염
특정 오염 물질을 제어하는 핵심은 때때로 그 물질을 얼마나 쉽게 검출할 수 있는지와 관련이 있습니다. 세균, 곰팡이, 효모 등의 오염 물질은 종종 육안으로도 확인할 수 있으며 배양된 세포를 빠르게 사멸시킬 수 있지만, 미코플라스마와 같은 중요한 미생물 침입자는 형태학적 특징이 미묘하여 식별하기가 더 어려울 수 있습니다. 이에 비해 바이러스는 기존의 광학 현미경으로는 전혀 검출할 수 없기 때문에, 원인을 알 수 없는 세포 탈락이나 세포 건강 악화, 심지어 세포 사멸과 같은 징후를 관찰한 후에야 비로소 발견되는 경우가 많습니다.
최근 몇 년간 생물학계가 직면한 가장 중요한 문제 중 하나는 연구용 세포주의 오염 또는 심지어 명백한 오식별입니다. 이 중요한 주제에 대해 더 자세히 알아보려면 여기를 클릭하여 교차 오염된 세포주의 원인과 유병률, 그리고 세포주 정체성의 무결성을 평가하는 방법을 확인해 보십시오.
세균, 곰팡이(곰팡이류 포함) 및 효모에 의한 오염은 일반적으로 배지의 급격한 탁도 증가 및 색상 변화로 육안으로도 확인할 수 있습니다(단, 배지에 가장 일반적인 무독성 pH 지시약인 페놀 레드가 첨가된 경우). 표준 광학 현미경 관찰을 통해서도 세균 세포와 진균 구조를 확인할 수 있으므로, 배양물을 매일 현미경으로 관찰하면 미생물 오염을 조기에 발견할 수 있으며, 첫 징후가 나타나자마자 적절한 조치를 취할 수 있습니다. 특히, 인접한 배양물뿐만 아니라 배양 인큐베이터, 수조, 생물안전 캐비닛을 포함한 무균 조직 배양 환경을 보호하기 위해서는 오염된 배양물을 즉시 제거해야 합니다. 또한, 일상적이고 정기적인 품질 관리 선별 절차의 일환으로 세균 및 곰팡이에 대한 특정 검사를 실시해야 합니다.
미생물 오염의 일반적인 원인과 예방
마이코플라즈마는 세포벽을 가지고 있지 않은 세균 속으로, 따라서 세포벽 형성을 억제하여 세균의 성장을 제한하는 항생제의 영향을 받지 않습니다. 유연한 형태와 0.15~0.3 µm 범위의 세포 크기 때문에, 일반적으로 0.22 µm 기공 크기의 필터를 사용하는 표준 세포 배양 여과 방식으로는 포착되지 않을 수 있습니다. 대부분의 다른 세균 오염원과 달리, 마이코플라스마는 육안으로 확인하기 어렵고, 그 형태와 특히 작은 크기 때문에 광학 현미경으로도 탐지하기 어렵습니다. 배양액 내 마이코플라스마 농도는 배지의 탁도를 유발하지 않으면서도 10⁸ 개체/mL에 달할 수 있습니다. 마이코플라스마는 일반적으로 감염된 포유류 세포를 사멸시키지는 않지만, 세포 대사를 변화시키고, 염색체 이상을 유발하며, 세포 성장을 지연시키고, 세포 부착을 방해함으로써 배양에 상당한 영향을 미칩니다. 요컨대, 마이코플라스마는 감염된 세포주를 사용하여 수행되는 대부분의 실험 결과에 극적인 영향을 미칠 가능성이 높습니다.
그림 2.DAPI나 Hoechst와 같은 일반적인 DNA 검출제는 형광 현미경을 통해 오염된 배양액(오른쪽)에서 마이코플라스마의 존재를 밝혀낸다.
실험실에서 마이코플라스마 오염의 원인이 다양하다는 점은 해결해야 할 과제가 될 수 있습니다. 특정 마이코플라스마 종은 사람의 피부에서도 발견되므로, 태아 소 혈청과 같은 오염된 배양 보조제를 통한 유입 외에도 부적절한 무균 조작으로 인해 유입될 수 있습니다. 마이코플라스마는 인근의 오염된 세포 배양액 간에 매우 쉽게 전파됩니다. 0.22 또는 0.45 µm 크기의 기공을 가진 표준 배지 여과 장치로는 이 작은 미생물을 걸러낼 수 없으므로, 마이코플라스마 처리를 위해서는 0.1 µm 이하의 기공을 가진 막을 사용하여 배지와 완충액을 여과해야 합니다.
마이코플라스마 오염의 예방, 검출 및 제거
마이코플라스마가 배양물에 한 번 오염되면 실험실의 다른 구역으로 빠르게 확산될 수 있습니다. 우수 실험실 관리 기준(GLP)을 엄격히 준수하는 것이 핵심이며, 마이코플라스마 오염을 성공적으로 통제하기 위해서는 정기적인 마이코플라스마 검사를 적극 권장합니다. 가장 널리 사용되는 세 가지 검출 방법으로는 마이코플라스마 배양, DNA 염색법, PCR 기반 검출법이 있습니다. 당사는 마이코플라스마 검출 및 제거를 위한 다양한 솔루션을 제공합니다. 실험실에 이 오염 물질의 존재가 의심되지 않더라도 배양물에 대한 마이코플라스마 선별 검사를 정기적으로 실시하는 것이 매우 중요합니다.
미생물 오염 방지: 항생제가 해답일까? 조직 배양 분야에서 흔히 볼 수 있는 관행 중 하나는 항생제를 단독으로 또는 항진균제와 혼합하여 일상적으로 사용하는 것이다. 의사가 처방하는 치료용 항생제와 마찬가지로, 항생제의 지속적이거나 부적절한 사용은 근절하기 어려운 내성 균주의 출현으로 이어질 수 있으며, 이로 인해 세포 배양에 독성을 나타낼 수 있는 차세대 항생제의 사용이 필요해질 수도 있다. 최근 연구에서는 항생제가 존재하는 환경에서 배양된 세포의 유전자 발현이 변화할 가능성에 대한 추가적인 우려가 제기되고 있다. |
바이러스 오염
바이러스는 세포 배양 과정에서 검출하기 가장 어려운 오염원 중 하나로, 대부분의 연구실에서는 실용적이지 않은 현미경 관찰 방법을 필요로 합니다. 바이러스는 환자나 숙주 동물의 세포 공급원에서 유래할 수 있으며, 생명공학적으로 중요한 여러 세포주에서 내인성 레트로바이러스가 검출된 바 있습니다. 더 흔한 경우는, 세포 배양에 사용되는 동물 유래 물질에 존재하는 바이러스에 의해 세포가 감염되는 경우입니다. 바이러스는 크기가 매우 작기 때문에 배지, 혈청 및 기타 생물학적 유래 용액에서 제거하기가 매우 어렵습니다. 그러나 대부분의 바이러스는 숙주, 심지어 조직에 국한되어 있기 때문에, 이로 인해 종간 또는 조직간 감염 능력이 제한될 수 있습니다. 바이러스는 많은 연구자들이 인식하는 것보다 세포 배양에서 더 흔하게 발견될 수 있지만, 세포에 세포병증이나 기타 악영향을 유발하지 않는다면 세포 배양에 있어 유의미한 교란 요인이 될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있습니다.
배양 세포에 영향을 미칠 가능성 외에도, 바이러스에 감염된 세포 배양물을 사용할 때의 주요 우려 사항은 실험실 직원에게 초래할 수 있는 잠재적 건강 위험이다. 인간이나 다른 영장류의 조직이나 세포를 다룰 때는 세포 배양에서 실험실 직원으로의 바이러스 감염(HIV, B형 간염, 엡스타인-바 바이러스, 원숭이 헤르페스 B 바이러스 등) 전파 가능성을 방지하기 위해 항상 특별한 안전 예방 조치를 취해야 합니다. 잠재적으로 위험한 조직, 배양물 또는 바이러스를 다루는 절차에 대해서는 기관의 환경 안전 담당자와 상담해야 합니다. 세포 배양을 다루는 실험실 직원에 대한 위험 평가에 대한 자세한 내용은 여기를 클릭하십시오
세포 배양의 바이러스 오염 발생률을 줄이기 위한 모범 사례:
*세포를 추출하는 생물학적 공급원(공급업체, 동물)의 수를 제한하십시오.
*바이러스에 덜 취약한 동물/세포를 선택하십시오.
*바이러스 검사를 수행하고 무바이러스 세포주 인증서를 제공하는 저장소에서 세포를 조달하십시오.
화학적 오염
세포 배양에 존재하는 비생물성 오염 물질은 대개 ‘화학적’ 오염 물질로 분류됩니다. 이러한 오염 물질은 배지나 완충액에 사용되는 시약이나 물, 또는 장비 및 소모품에서 유래할 수 있습니다. 예로는 자유 라디칼, 금속 이온, 소독제/세제 잔류물, 심지어 상류 단계의 세균성 오염 물질이 더 이상 존재하지 않더라도 잔류하는 내독소 등이 있습니다.
화학적 오염 방지를 위한 요령:
*버퍼 및 용액 조제, 동결건조 시약의 재현탁 시에는 항상 실험실용 순수를 사용하십시오.
*재사용 가능한 모든 실험 기구는 철저히 헹구고 자연 건조해야 합니다. 오토클레이브 소독은 세제 잔류물에 아무런 효과가 없습니다.
*배지, 보충제 및 혈청(FBS, FCS)은 반드시 내독소 검사 인증서를 제공하는 공급업체에서만 구입하십시오.
오염을 예방하고 제거하기 위한 일반적인 요령 및 기법
생물안전캐비닛 내 작업
생물안전 캐비닛 내에서 작업할 때는 공기 흐름이 무균 환경을 유지하는 데 핵심이라는 점을 기억하는 것이 도움이 됩니다. 효과적인 공기 흐름을 확보하기 위해 후면 및 전면 통풍구는 항상 막히지 않도록 해야 합니다. 실습 절차를 시작하기 전에, 작업자의 소매와 손을 통해 오염 물질이 옮겨질 가능성을 최소화하기 위해 캐비닛 내에 필요한 모든 재료를 미리 비치해 두어야 합니다.
공기 흐름이 시작된 후 최소 20분이 경과해야 캐비닛 내에 사용할 물품을 넣을 수 있습니다. 캐비닛으로 반입되는 모든 물품은 먼지와 미립자가 캐비닛 내부로 유입되는 것을 방지하기 위해 먼저 70%(v/v) 무균 알코올을 분사한 후 보풀이 없는 물티슈로 닦아야 합니다. 뚜껑이나 용기를 열기 전에 공기 흐름이 안정적으로 정착되었는지 확인하여, 공기 흐름을 통해 작업 영역에 유입되었을 수 있는 미립자를 제거할 수 있도록 해야 합니다.
그림 3.안전 캐비닛에서 작업하기
피펫팅 및 에어로졸 방지
1~100 mL 용량의 일회용 플라스틱 피펫(혈청학적 피펫이라고도 함)은 세포 배양에 없어서는 안 될 도구입니다. 무균 상태를 보장하기 위해 이 피펫들은 개별 포장되어 있어야 합니다. 다음 지침을 준수하면 피펫팅과 관련된 오염 및 안전 위험을 최소화할 수 있습니다.
- 자동 피펫팅 보조 장치를 사용하되, 각 보조 장치는 단일 캐비닛 내에서만 사용하도록 제한하십시오. 오염을 방지하기 위해 피펫팅 보조 장치의 부품을 정기적으로 분해하여 소독하십시오. 피펫팅 보조 장치용 필터를 충분히 비축해 두고 정기적으로 교체하십시오.
- 가능한 한, 특히 배지를 옮길 때는 상단이 면으로 막힌 피펫(플러그형 피펫)을 사용하십시오. 피펫 플러그 안으로 액체가 빨려 들어가지 않도록 주의하십시오. 플러그가 실수로 젖은 경우, 즉시 피펫 보조기 필터를 교체하십시오.
- 피펫을 부분적으로만 개봉하고, 끝부분을 피펫 어댑터에 끼운 다음 종이 슬리브를 제거함으로써 혈청용 피펫에 직접 접촉하는 것을 완전히 피하십시오.
- 오염을 유발하는 에어로졸이 발생하지 않도록 배지나 피펫 내에 기포가 생기지 않도록 하십시오.
소독
배양 폐기물, 작업대 및 장비의 소독/제염을 위해 고안된 방법은 오염 위험을 최소화할 뿐만 아니라 실험실 직원에게도 안전해야 합니다. 농축된 형태의 소독제를 사용할 때는 항상 장갑 및 안구 보호구와 같은 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오. 선택한 장갑은 취급하는 물질로부터 보호할 수 있어야 합니다. 제조업체의 표를 참고하면 특정 작업에 가장 적합한 장갑을 파악하는 데 도움이 됩니다. 주요 소독제는 여러 그룹으로 나뉘며, 각 그룹의 상대적 장점은 다음과 같이 요약할 수 있습니다:
차아염소산나트륨 또는 표백제
- 우수한 범용 소독제
- 바이러스에 효과적
- 금속에 부식성을 띠므로 원심분리기와 같은 금속 표면에는 사용해서는 안 됨
- 유기물에 의해 쉽게 불활성화되므로 자주 새로 만들어야 함
- 시판되는 표백제를 사용하여 폐액에 10%(v/v) 용액을 만들거나 표면 소독에 사용하십시오
알코올(예: 에탄올, 이소프로판올)
- 유효 농도: 에탄올 70%, 이소프로판올 60~70%
- 박테리아에 효과적입니다. 에탄올은 대부분의 바이러스에 효과적이지만, 비막성 바이러스에는 효과가 없습니다
- 이소프로판올은 바이러스에 대해 효과가 없습니다
- 알데히드는 자극성이 있으므로 사용을 제한해야 합니다
페놀계 소독제는 EU 살생물제 지침(Biocidal Products Directive) 재검토 프로그램의 적용 대상에서 제외되므로 사용을 피해야 합니다.
건강한 세포에 대한 정기 모니터링 수행 방법
세포 배양 모니터링은 일상적인 세포 배양 작업에서 중요한 부분입니다. 이 튜토리얼에서는 건강한 배양 상태의 모습, 세포 밀도, 세포 배양 성장의 여러 단계 등을 포함하여 세포 모니터링의 기본 사항을 설명해 드립니다. 또한 이 영상에서는 세균 및 마이코플라스마 오염의 일반적인 징후도 보여드립니다.