TAT-recombinasa Cre

Cada lote de proteína TAT- recombinasa Cre se somete a rigurosas pruebas de control de calidad para los siguientes parámetros:

• Pureza: una sola banda de unos 41 kDa con una pureza proteica superior al 70 % en un gel SDS-PAGE
• Actividad funcional: interviene en la recombinación de alelos modificados en LoxP en una línea celular reportera HEK293T-Cre
• Niveles de endotoxina: menos de 1 UE/ug de proteína

EMD Millipore ha desarrollado una proteína de fusión TAT - recombinasa Cre permeable a la célula que se puede administrar directamente a células de mamíferos y produce una elevada eficiencia de recombinación (75 – 100 % en ratón y ~ 60 % en células humanas). La TAT-CRE se transloca fácilmente a las células de mamífero y puede catalizar una recombinación muy eficiente. La dosis y el tiempo de exposición a la Cre se pueden controlar con precisión, lo que permite una valoración cuidadosa de la actividad Cre.

La recombinasa Cre es una enzima procedente del bacteriófago P1 que cataliza la recombinación específica de sitio entre dos sitios de reconocimiento de ADN denominados sitios loxP. El sitio de reconocimiento LoxP consta de dos repeticiones invertidas de 13 pb que flanquean una región espaciadora de 8 pb. Debido a que el gen Cre y los sitios loxP no son nativos de los genomas de la mayoría de las especies, los sitios LoxP pueden ser genomanipulados e introducidos en las células diana y, por lo tanto, utilizados como un medio para controlar con precisión la expresión de los genes in vitro (es decir, células cultivadas) e in vivo (es decir, modelos animales).

• Si los sitios LoxP se encuentran en diferentes cromosomas, la recombinasa Cre mediará una translocación cromosómica.
• Si los sitios LoxP están orientados en la dirección opuesta, la recombinasa Cre mediará una inversión del segmento floxado.
• Si los sitios LoxP están orientados en la misma dirección, la recombinasa Cre mediará la deleción del segmento floxado.

De esta manera, la ubicación de los sitios LoxP permite que los genes sean activados, reprimidos o intercambiados por otros genes.

TAT-recombinasa Cre de EMD Millipore es una proteína de fusión recombinante permeable a la célula que consiste en un péptido de translocación proteica básico derivado del VIH-TAT (TAT), una secuencia de localización nuclear (NLS), la proteína Cre y una etiqueta de histidina N-terminal (H6) para la purificación eficiente de la proteína de E. coli.

Se ha demostrado que la proteína TAT-recombinasa Cre de EMD Millipore escinde eficazmente los transgenes víricos STEMCCA de las células iPS humanas y de ratón.

Un patrón de 100 unidades se define como la cantidad de TAT-CRE (ug) en 1,0 ml de medio de cultivo tisular que se requiere para inducir la expresión del 50 % de la GFP en un análisis de línea celular reportera de loxp HEK293T.

La proteína recombinante se suministra en tampón que contiene glicerol al 50 % (v/v) NaCl 500 mM y HEPES 20 mM a pH 7,4

Estable durante 3 meses desde la fecha de recepción cuando se conserva a -20°C o -80°C. Tras la primera descongelación, centrifugue el vial y mezcle suavemente la disolución. Distribuir en alícuotas de volumen de trabajo más pequeñas y congelar a -20°C o -80°C. Antes de su uso, diluya el TAT-CRE a la concentración adecuada con medio de cultivo y filtre a través de un filtro de jeringa de baja adsorción de proteínas de 0,2 um (Millipore Nº de ref. SLGV 033RS O SLGV013 SL).