Kit de etiquetado de ARN DIG (SP6/T7)

Sólo para investigación en ciencias de la vida. No indicada para procedimientos diagnósticos.

1 kit que contiene 12 componentes.

Kit para el marcaje ARN con digoxigenina-UTP mediante transcripción in vitro con las polimerasas SP6 y T7. Mediante este método, se producen sondas de ARN monocatenario de longitud conocida, que pueden ser utilizadas una variedad de técnicas de hibridación.

Tiempo de ensayo: 145minutes
Material de muestra

• ADN plasmídico linealizado
• Producto de PCR

Principio
El kit de marcaje del ARN con DIG produce sondas de ARN monocatenario de longitud conocida marcado con DIG. La ARN polimerasa SP6 o la T7 transcriben esas sondas in vitro a partir del molde de ADN (en presencia de digoxigenina-UTP).
Marcaje de ARN mediante transcripción in vitro
El ADN que va a transcribirse se clona en el sitio de policlonación de los vectores de transcripción apropiados (por ejemplo, pSPT 18 o 19), que contienen los promotores para las ARN polimerasas SP6 y T7. El molde de ADN adyacente se linealiza en un sitio adecuado y se utilizan las ARN polimerasas para producir transcritos «run off». El DIG-UTP se incorpora en el transcrito. Cada 20 a 25 nucleótidos del ARN recién sintetizado es un DIG-UTP. Dado que la concentración de nucleótidos no se convierte en un factor limitante de la reacción de transcripción convencional, esta reacción puede generar grandes cantidades de ARN marcado.

Estamos comprometidos a proporcionarle los productos alternativos más sostenibles, que se adhieran a uno o más de los 12 principios de la química sostenible. Este producto está diseñado como un compuesto químico más seguro.  El sistema DIG se estableció como una alternativa sensible y rentable al uso de la radioactividad para el marcaje y la detección de los ácidos nucleicos. En muchas publicaciones se demuestra la versatilidad del sistema DIG, por lo que el radiomarcaje ya no es la única opción de marcaje del ADN para hibridación.

Principio de la prueba El ADN molde que va a transcribirse se clona en el sitio de policlonación de los vectores de transcripción apropiados, que contienen los promotores para las ARN polimerasas SP6 y/o T7. Después de la linealización en un sitio adecuado, el ARN se transcribe en presencia de DIG-UTP. En condiciones estándar, se transcriben aproximadamente 10μg de ARN de longitud completa marcado con DIG a partir de 1μg de la plantilla.

Para el marcaje de ARN con DIG-11-UTP mediante transcripción in vitro con ARN polimerasas SP6 y T7. Los transcritos «run off» marcados con DIG se sintetizan con gran eficiencia y pueden utilizarse en una variedad de técnicas de hibridación:

• Inmunotransferencias Northern
• Inmunotransferencias Southern
• Hibridaciones in situ
• Transferencia de placas o colonias
• Experimentos de protección de ARNasa

Debido a los sistemas de detección de gran especificidad y sensibilidad, las sondas marcadas con DIG pueden utilizarse para la detección de una sola copia de un gen en 1μg de ADN humano total.
Nota: Dado que el enlace entre DIG y UTP es resistente a los álcalis, el ARN marcado con DIG puede fragmentarse mediante tratamiento alcalino. La reducción ligera del tamaño de la sonda de ARN marcada con DIG puede hacerla más adecuada para ciertas aplicaciones de hibridación in situ.

Sensibilidad y especificidad:
Las sondas de ARN marcadas con DIG pueden detectar copias únicas de genes en tan sólo 1 μg de ADN de mamífero bajo las condiciones de análisis siguientes: La mezcla de hibridación contiene de 20 a 100 ng de sonda marcada/ml, y la sonda unida se detecta con anti-DIG-AP y se visualiza con el sustrato quimioluminiscente CDP-Star.
Inactivación por calor: Interrupción de la reacción añadiendo 2 μl de EDTA 0,2 M (pH 8,0).