Colagenasa from Clostridium histolyticum

La enzima se ha utilizado también junto con otras proteasas para la disgregación de tumores humanos, riñón de ratón, cerebro humano y tejidos epiteliales de pulmón. También es útil en los estudios de perfusión de hígado y riñón, de digestión del páncreas, de aislamiento de las células hepáticas no parenquimatosas y los hepatocitos de rata. La enzima de Sigma se ha utilizado para la digestión del colágeno de tipo I procedente de los huesos trabeculares y corticales bovinos. También se ha utilizado como control positivo en el análisis FALGPA en células de Streptococci del Grupo B.

Adecuada para utilizar en la preparación de suspensiones monocelulares para secuenciación.

La colagenasa es activada por cuatro átomo-gramos de calcio por mol de enzima. Es inhibida por el ácido etilenglicol-bis(beta-aminoetil éter) - N, N, N′,N′-tetraacético, el beta-mercaptoetanol, el glutatión, el ácido tioglicólico y la 8-hidroxiquinolina.

La liberación eficaz de las células desde los tejidos requiere la acción de las colagenasas y de la proteasa neutra. La colagenasa es activada por cuatro átomo-gramos de calcio (Ca²⁺) por mol de enzima. Se piensa que el filtrado de cultivo contiene como mínimo 7 proteasas diferentes cuyos pesos moleculares oscilan entre 68 y 130 kDa. El pH óptimo se encuentra entre 6,3 y 8,8. La enzima se utiliza normalmente para digerir los componentes conectivos de las muestras de tejido con el fin de liberar células individuales. El tratamiento con colagenasa puede causar la muerte de algunas células. Normalmente se utilizan concentraciones que van de 0,1 a 5 mg/ml para la digestión. La duración de la reacción varía de 15 minutos a varias horas para una eficiencia satisfactoria de la disociación celular sin causar demasiada muerte celular. Se prefiere la disolución tampón de Krebs Ringer con calcio y BSA y se requiere Zn²⁺ para que haya actividad. La enzima reconoce la secuencia -R-Pro-8-X-Gly-Pro-R-, donde X suele ser un aminoácido neutro. Se sabe que el ácido etilenglicol-bis(β-aminoetil éter)-N,N,N′,N′-tetraacético (EGTA)4; el β-mercaptoetanol; el glutatión(reducido); el ácido tioglicólico de sodio; el 2,2′-dipiridil; la 8-hidroxiquinolina y la cisteína inhiben la actividad de la enzima.

Este producto es equivalente a la primera fracción de sulfato de amonio al 40% de Mandl, I., et al., J. Clin. Invest., 32, 1323 (1953). Las disoluciones se preparan normalmente a una concentración de 1-2 mg/ml en tampón TESCA (que contiene TES 50 mM, cloruro de calcio 0,36 mM a pH 7,4 y 37°C.)

Una unidad de digestión de colágeno (CDU) libera péptidos del colágeno del tendón de Aquiles bovino que equivalen en la reacción de color de la ninhidrina a 1,0 μmoles de leucina en 5 horas a pH 7,4 y 37 °C en presencia de iones calcio. Una unidad de hidrólisis FALGPA hidroliza 1,0 μmoles de furilacriloil-Leu-Gly-Pro-Ala por minuto a 25°C. Una unidad de proteasa neutra hidroliza la caseína para producir color equivalente a 1,0 μmoles de tirosina por 5 horas a pH 7,5 y 37°C. Una unidad de clostripaína hidroliza 1,0 μmoles de BAEE por minuto a pH 7,6 y 25°C en presencia de DTT.

Tal como se suministra, este producto es estable durante un año a -20°C. No hay pérdida de actividad FALGPA ni actividad proteasa en 30 días a 37°C, 50°C y -20°C. Las disoluciones de colagenasa cruda son estables si se congelan rápidamente en alícuotas (a 10 mg/ml) y se conservan congeladas a -20°C. Otros ciclos de congelación-descongelación dañarán la disolución. El producto retiene el 100 % de su actividad durante 7 horas si se conserva en hielo.