Disolución de tripsina-EDTA

La disolución de tripsina-EDTA se utilizó:

• en el desprendimiento de células de cáncer colorrectal humano HT29 cultivadas en RPMI 1640 que se enriqueció con suero de ternera fetal al 10 %, durante la determinación de la frecuencia celular relativa de muestras de elevada concentración.
• para digerir con tripsina la línea celular tcA-201 del riñón embrionario humano transfectada transitoria.
• para liberar enzimáticamente los fibroblastos de ratón (línea celular L929) adheridos al andamio durante el cultivo celular para evaluar la influencia de varios tratamientos modificados de los andamios y fibras de no tejido de poli(L/D)lactida 96/4.
• para disociar las células de la placa de cultivo destinadas a análisis de citometría de flujo.

Adecuada para ser utilizada en la preparación de suspensiones monocelulares para secuenciación.

La utilización habitual de este producto es la separación de las células adherentes de una superficie de cultivo. La concentración necesaria de tripsina para separar las células de su sustrato depende fundamentalmente del tipo de célula y de la edad del cultivo.

La tripsina rompe los péptidos por el lado C-terminal de los restos de lisina y de arginina. La velocidad de hidrólisis de esta reacción se reduce si a cada lado del punto de rotura hay un residuo ácido, y la hidrólisis se interrumpe si en el lado carboxilo del sitio de ruptura hay un resto de prolina. El pH óptimo de actividad de la tripsina es 7-9. La tripsina también puede actuar rompiendo las uniones éster y amida de los derivados sintéticos de aminoácidos. Se añade EDTA a las disoluciones de tripsina como agente quelante que neutraliza los iones de calcio y de magnesio, los cuales ocultan los enlaces peptídicos sobre los que actúa la tripsina. La eliminación de esos iones aumenta la actividad enzimática.

Los inhibidores de las proteasas de serina, como DFP, TLCK, APMSF, AEBSEF y la aprotinina, entre otros, inhibirán la tripsina.

Este producto se almacena congelado entre -10 y -40°C. Deben evitarse ciclos repetidos de congelación y descongelación.

La tripsina consiste en una sola cadena polipeptídica de 223 restos de aminoácidos, producida por la eliminación del hexapéptido N-terminal del tripsinógeno, que es hidrolizado en el enlace peptídico entre Lys e Ile. La secuencia de aminoácidos está entrecruzada por 6 puentes disulfuro. Esta es la forma nativa de la tripsina, la beta-tripsina. La BETA-tripsina puede autolisarse, rompiendo en el resto Lys - Ser, para producir alfa-tripsina. La tripsina es miembro de la familia de proteasas de serina.

Disolución de tripsina (2,5 g/l de tripsina porcina y 0,2 g/l de EDTA•4Na en la disolución salina equilibrada de Hank con fenol rojo, 1X, probada para cultivo celular)

Este producto no contiene rojo de fenol. Debido al transporte en hielo seco, podría haber una acumulación significativa de dióxido de carbono en el envase. Este CO₂ puede entrar en la disolución y reducir ligeramente el pH, produciendo un color naranja más que rosáceo. La disolución naranja podrá seguir utilizándose o podrá ajustarse el pH con hidróxido de sodio. La incubación de las células con una concentración demasiado elevada de tripsina durante un largo período puede dañar las membranas celulares y destruir las células. La solubilización de tripsina o su dilución a partir de una disolución concentrada debe realizarse con una disolución salina tamponada que no contenga Ca²⁺ ni mg²⁺.