ColorWheel^®フローサイトメトリープロトコル

以下のプロトコルは、ColorWheel^®抗体とColorWheel^®色素を用いたフローサイトメトリー分析のガイドラインです。フローサイトメトリープロトコルで使用できるColorWheel^®抗体・色素混合液を作るためには、両製品が必要です。

• 関連製品
• 抗体調製プロトコル
• PBMCサンプル調製プロトコル
• 細胞表面染色プロトコル
• 細胞内（細胞質）染色プロトコル
• 関連するColorWheel^®製品

関連製品

• ColorWheel^® 色素セット（ColorWheel^®フィニッシングバッファーを同梱）
• ColorWheel^®抗体
• DPBS：製品番号D8537またはD1408 （10X濃縮液）
• RPMI 1640培地製品番号R0883-500ML
• ウシ胎児血清（DPBS）：製品番号TMS-013-B
• GlutaMAX™サプリメント：ThermoFisherカタログ番号35050079
• ペニシリン-ストレプトマイシン（100X）：製品番号P4333
• 凍結PBMCバイアル：IQ Biosciencesカタログ番号IQB-PMBC102
• ウシ血清アルブミン（BSA）：製品番号A3059
• アジ化ナトリウム：製品番号71289
• 0.5 Mエチレンジアミン四酢酸（EDTA）：製品番号03690
• FACSバッファー（5% BSA、2 mM EDTA、0.1% アジ化ナトリウム含有DPBS）
• ヒトFcブロッキング溶液：BD Biosciencesカタログ番号564219
• 16% ホルムアルデヒド：ThermoFisherカタログ番号28908
• 10X透過処理バッファー（0.1% サポニン、0.09%アジ化ナトリウム含有DPBS）：ThermoFisherカタログ番号00-8333-56

お客様の実験に適した蛍光色素の選択に関するヒントは、フローサイトメトリー用色素の選び方およびマルチカラーフローサイトメトリー：パネル構築のヒントとツールをご覧ください。

抗体調製プロトコル

1. ColorWheel^®色素をDPBS 25 µLで溶解します。
2. ColorWheel^®抗体をDPBS 25 µLで溶解します。
3. ColorWheel^®フィニッシングバッファーをDPBS 25 µLで溶解します。
4. ColorWheel^®色素25 µL（ステップ1）をColorWheel^®抗体25 µL（ステップ2）に加え、ColorWheel^®抗体・色素混合液50 µLを作ります。チューブに適切にラベルを貼ります。
5. ColorWheel^®抗体・色素混合液を室温・暗所で30分間インキュベートします。
6. ColorWheel^®フィニッシングバッファー5 µL（ステップ3）をColorWheel^®抗体・色素混合液50 µL（ステップ4）に加え、ColorWheel^®サンプル添加溶液55 µLを作ります。
7. ColorWheel^®サンプル添加溶液を室温で30分間インキュベートします。
8. ColorWheel^®サンプル添加溶液は直ちに使用するか、使用するまで4℃で保管します。

詳しくは、シンプルなColorWheel^®フローサイトメトリー用試薬の3ステップ調製プロトコルをご覧ください。

PBMCサンプル調製プロトコル

1. RPMI 1640完全培地（10% FBS、2 mM GlutaMAX™サプリメント、ペニシリン100単位/mL、ストレプトマイシン100 µg/mL含有）を37℃のウォーターバスで温めます。
2. 凍結PBMCバイアルを取り出し、37℃のウォーターバスで細胞を速やかに解凍します。
3. 細胞溶液を50 mLのコニカル遠心チューブに移します。
4. RPMI完全培地9 mLを1滴ずつ加えます。
5. 400 x gで5分間遠心します。
6. 上清を廃棄し、DPBS 10 mLで細胞を洗浄します。
7. 400 x gで5分間遠心します。
8. 上清を廃棄し、細胞1 x 10⁶ 個/mLをFACSバッファー（5% BSA、2 mM EDTA、0.1% アジ化ナトリウム含有DPBS）で再懸濁します。

細胞表面染色プロトコル

1. 各チューブに細胞1 x 10⁶個を分注します。
2. 細胞表面の非特異的なFc受容体を、適切なFcブロッキング溶液でブロックします。
3. 室温で10分間インキュベートします。
4. 細胞を染色するために、細胞1 x 10⁶個あたり5 µLのColorWheel^®サンプル添加溶液を添加します。
5. 暗所において4℃で30分以上インキュベートします。
6. 細胞を400 x gで5分間遠心します。
7. 上清を廃棄し、チューブあたり2 mLのDPBSで細胞を洗浄します。
8. ステップ6～7をさらに2回繰り返します。
9. 細胞を400 x gで5分間遠心します。
10. 上清を廃棄し、FACSバッファー2 mLで細胞を再懸濁します。
11. フローサイトメトリーでサンプルを分析します。

細胞染色に関する詳しいアドバイスについては、フローサイトメトリートラブルシューティングガイドをご確認ください。

細胞内（細胞質）染色プロトコル

1. 各チューブに細胞1 x 10⁶個を分注します。
2. 細胞を400 x gで5分間遠心します。
3. 上清を廃棄し、2～4%のホルムアルデヒド含有DPBS 1 mLにより室温で10分間、細胞を固定します。
4. 細胞を400 x gで5分間遠心します。
5. 上清を廃棄し、チューブあたり2 mLのFACSバッファーで細胞を洗浄します。
6. ステップ4～5をもう1回繰り返します。
7. 細胞を400 x gで5分間遠心します。
8. 上清を廃棄し、5% BSAと適切なFcブロッキング溶液を含む透過処理バッファー（0.1% サポニン、0.09% アジ化ナトリウム含有DPBS）1 mLで細胞を再懸濁します。
9. 室温で30分間インキュベートして細胞をブロックします。
10. 細胞を染色するために、細胞1 x 10⁶個あたり5 µLのColorWheel^®サンプル添加溶液を加えます。
11. 暗所において4℃で30分以上インキュベートします。
12. 細胞を400 x gで5分間遠心します。
13. 上清を廃棄し、チューブあたり2 mLの透過処理バッファーで細胞を洗浄します。
14. ステップ12～13をさらに2回繰り返します。
15. 細胞を400 x gで5分間遠心します。
16. 上清を廃棄し、FACSバッファー2 mLで細胞を再懸濁します。
17. フローサイトメトリーでサンプルを分析します。

ColorWheel^®製品についてご質問があれば、ColorWheel^® フローサイトメトリー用抗体・色素よくあるお問い合わせをご確認ください。

関連するColorWheel^® 製品

ColorWheel^®テクノロジーには、マルチカラー分析などのフローサイトメトリー研究用として、ColorWheel^®抗体とColorWheel^®色素の両方が必要です。抗体と色素は別売りです。初回注文時の割引については、試供品に関する資料請求よりお問い合わせください。