mRNA 백신 및 치료제를 위한 제조 전략
개발에서 임상에 이르는 기간을 단축할 수 있는 mRNA 기술은 감염병 발생에 신속하고 효과적으로 대응할 수 있을 뿐만 아니라 미충족 수요가 있는 질병을 해결하기 위한 새로운 치료제 개발에도 가능성을 제시합니다. mRNA 기술은 우수한 안전성 프로파일, 높은 수준의 다목적성, 템플릿화된 제조 공정 등 다양한 이점을 제공합니다.
mRNA 백신의 초기 성공에 힘입어 오늘날의 mRNA 제조업체는 mRNA 안정성을 개선하고 pDNA 및 mRNA 정제를 개선하고 GMP 생산까지 확장하는 전략을 구현함으로써 생산 공정의 효율성과 생산성을 개선하고자 노력하고 있습니다.
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섹션 개요
mRNA 제조에 대한 고려사항
mRNA 백신 및 치료제는 일반적으로 템플릿화된 공정을 따릅니다(그림 1). 이 간소화된 제조 템플릿은 모든 표적에 동일한 반응 물질을 사용하며, mRNA 제조업체가 최소한의 공정 조정으로 새로운 표적 분자를 생산할 수 있게 해줍니다.
그림 1.mRNA 제조에 대한 일반적인 프로세스 개요.
몇 가지 주요 결정이 최종 mRNA 제품의 공정, 수율 및 품질에 큰 영향을 미치며, 그중 하나가 공정 화학물질 및 원료의 품질입니다. 특히 <체외 전사> 및 다운스트림 정제 과정에서 mRNA는 보호되지 않고 효소 분해의 위험이 높습니다. 엔도뉴클레아제 활성 부재 테스트를 거친 고품질 화학물질을 사용하면 RNase에 의한 분해 위험을 최소화하고 mRNA 의약품의 정제 및 제형 과정에서 mRNA 안정성을 개선할 수 있습니다.
이 웹페이지에서는 mRNA 제조를 간소화하도록 설계된 당사의 포괄적이고 통합된 솔루션에 대한 정보를 제공하여 이러한 문제와 기타 문제를 해결하는 데 도움을 드립니다. 당사 브로셔 <"mRNA 의약품 제조를 위한 공정 화학물질에서는 정보에 입각한 선택을 하는 데 필요한 세부 정보를 제공합니다.
그림 2.mRNA 구조.
- 서열의 5' 끝에 있는 캡 영역: mRNA 성숙, 효율적인 단백질 번역을 위한 리보솜의 인식, 안정성 향상을 위한 뉴클레아제 소화로부터 보호에 필수.
- mRNA 코딩 영역의 업스트림 및 다운스트림 도메인에 있는 미번역 영역(UTR)
- 단백질 발현 효율을 향상시키는 데 활용할 수 있습니다: mRNA 번역, 국소화 및 안정성 조절; 단백질 발현 효율 향상에 활용 가능.
- 오픈 리딩 프레임 또는 코딩 서열 영역: 관심 유전자(GOI)를 포함합니다.
- Poly(A) 꼬리: 3' 엑소뉴클레아제에 의한 소화를 방지하여 단백질 번역 및 mRNA 안정성에 중요.
Making mRNA
mRNA 기반 치료제 및 백신 생산는 플라스미드 DNA(pDNA) 템플릿으로 시작하여 선형화하여 mRNA로 전사합니다.
- pDNA 생산: pDNA 템플릿에는 DNA 의존성 RNA 중합효소 프로모터와 mRNA 구성을 위한 서열이 포함되어 있습니다. pDNA는 박테리아 세포에서 증폭된 다음 수확 및 용해되어 원형 pDNA를 방출합니다. 이 용해물은 박테리아 세포의 pDNA와 RNA, 게놈 DNA, 내독소 등 음전하를 띠는 다른 큰 불순물을 포함하고 있어 매우 점성이 높아 정제가 어렵습니다.
- pDNA 정제: 불순물로부터 pDNA 템플릿을 정제하려면 플라스미드 템플릿의 기계적 손상 가능성을 최소화하면서 분리를 최대화해야 합니다. 그런 다음 정제된 원형 pDNA를 선형화하여 제거해야 하는 원치 않는 mRNA 서열 변이를 생성할 수 있는 전사적 리드스루 이벤트를 방지합니다.1 이렇게 선형화된 pDNA 템플릿을 추가로 정제하여 선형화에 사용되는 제한 효소, 소 혈청 알부민(BSA), DNA 단편 및 내독소 같은 불순물을 제거합니다. pDNA 템플릿은 일반적으로 박테리아 세포에서 생성되기 때문에 내독소 불순물은 후속 정제 단계에 영향을 미치는 중요한 불순물입니다. Deviron® C16 세제와 같은 세제는 엔도톡신을 효과적으로 제거하는 데 사용할 수 있으며 기존 세제에 비해 지속가능하고 생분해성이며 REACH를 준수하는 대안이 될 수 있습니다.2
실험실과 GMP 생산 규모에서 pDNA 정제에 대한 접근 방식에는 현저한 차이가 있습니다. 실험실 규모의 공정에서는 종종 용매 추출 기술을 사용하여 다른 성분으로부터 pDNA를 분리하지만, 이러한 화학 물질을 대규모로 취급하고 폐기하는 것은 어려울 수 있습니다. 이에 비해 GMP 생산 환경에서는 일반적으로 효율적인 불순물 제거를 위해 접선 흐름 여과(TFF)와 크로마토그래피를 사용합니다.
체외 전사(IVT): 선형화 및 정제된 pDNA는 효소 반응을 통해 mRNA로 전사됩니다.
- 체외 전사에 중요한 구성 요소에는 DNA를 mRNA로 전사하는 것을 촉매하는 RNA 중합효소가 포함됩니다; mRNA의 구성 요소 역할을 하는 리보뉴클레오사이드 삼인산염(rNTP), mRNA 수율을 향상시키는 무기 피로인산화효소(IPP), RNA 분해를 방지하는 RNase 억제제 등이 있습니다. 전사 버퍼에는 일반적으로 이황화 결합을 줄이고 RNase 활성을 억제하는 디티오트레이톨(DTT)이 포함되며, 디티오트레이톨(DTT)는 스페르미딘는 전사 효율을 개선하고 핵산을 안정화하기 위해 포함되어 있습니다. 이 중요한 공정 단계에서 효소 분해의 위험을 최소화하려면 엔도뉴클레아제 활성이 없는지 테스트된 화학물질을 선택하는 것이 필수적입니다. 엔도뉴클레아제가 없는 광범위한 제품 포트폴리오를 포함하여 고품질 화학물질 및 부형제에 대한 포괄적인 개요를 보려면 브로셔 "mRNA 약물 제조용 공정 화학물질"을 참조하세요.
- 전사 모니터링: 중요 품질 특성(CQA)을 제어하고 최적의 처리를 보장하기 위해 IVT 반응 중에 중요 공정 파라미터(CPP)를 모니터링해야 합니다. 효과적인 모니터링은 보다 제어된 제조와 공정 변동성에 대한 빠른 대응을 가능하게 합니다.
캡핑: 전사 후 5' 캡 구조가 mRNA 전사에 추가되어 숙주 세포에서의 안정성과 전사를 개선합니다. 캡은 두 가지 방법으로 추가할 수 있습니다.
- 공동 전사 캡핑: IVT 단계에서 수행됩니다. 그러나 효율성과 수율이 낮고 이 접근법은 잘못된 결합 또는 역통합으로 인해 캡이 없는 불순물을 생성할 수 있습니다.
- 효소적 캡핑(또는 번역 후 캡핑)은 mRNA 정제 후에 수행됩니다. 이 접근법은 일반적으로 캡핑 효소를 사용하여 정제된 mRNA에 캡을 추가합니다. 이 접근법은 더 효율적이지만 비용이 더 많이 들고 정제 후 추가 처리 단계입니다.
정제 mRNA
in-vitro> 전사 후, 내독소, 면역원성 이중 가닥 RNA(dsRNA), 잔류 DNA 템플릿, RNA 중합효소 및 원소 불순물을 포함하여 이전 단계에서 사용된 불순물 및 물질로부터 mRNA를 정제합니다. mRNA 정제 및 잔류 DNA 제거.
역상 이온 쌍(IPRP)과 같은 크로마토그래피 분리, 음이온 교환(AEX) 와 폴리(dT) 포획(그림 3)을 이용한 친화성 크로마토그래피(AC)는 mRNA 표적을 효율적으로 정제하고 DNA 템플릿을 제거하여 DNA 분해1, 3가 필요 없습니다. 또한 효소 캡핑 후 크로마토그래피를 사용하여 원치 않는 mRNA 전사체와 올리고뉴클레오티드 불순물을 제거합니다.
그림 3:역상 이온 쌍, 음이온 교환 및 mRNA 정제를 위한 친화 크로마토그래피 비교(DBC: 동적 결합 용량).4,5
- 역상 이온 페어링(IPRP)은 표적 단일 가닥 RNA(ssRNA)를 효율적으로 포집하고 불순물로부터 분리하기 위해 소규모로 사용할 수 있습니다. 그러나 이 방법은 용매가 필요하기 때문에 GMP 제조에는 적합하지 않으며 포획보다는 연마에 더 적합합니다.
- 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피는 동적 결합 능력이 높고 dsRNA, 언캡핑 RNA, RNA-DNA 하이브리드 및 헤어핀 mRNA 같은 기타 RNA 구조와 같은 불순물을 효율적으로 제거할 수 있습니다. AEX는 수용액을 사용하지만, 수지에 결합된 큰 mRNA 분자를 흡착하기 위해 독성이 있는 카오트로픽 에이전트와 최대 85°C의 작동 온도가 필요합니다.
- 친화 크로마토그래피(AC) 폴리(dT) 캡처는 수지를 사용하여 전장 mRNA 전사체의 폴리(A) 꼬리 부분을 특이적으로 캡처하는 방식입니다. 이 방법은 DNA, 뉴클레오타이드, 효소, 버퍼 성분 및 폴리(A) 꼬리가 없는 기타 불순물을 효율적으로 제거합니다. 이러한 이유로 일반적으로 초기 mRNA 포획에는 AC를 사용하고 연마에는 AEX를 사용합니다.
- 최종 농축 및 한외 여과는 크로마토그래피 단계 후에 수행하여 제품 순도를 극대화하고 제제 또는 보관을 위해 적절한 버퍼로 mRNA를 옮깁니다.
스케일업 고려 사항
단일 사용 기술은 확장성, 적응성 및 품질을 제공하며 많은 mRNA GMP 제조 공정의 핵심 원동력이 되고 있습니다. GMP 제조는 소규모 공정 개발의 일반적인 대체 정제 방법을 대체하여 효율적인 대규모 분리를 위해 TFF 또는 크로마토그래피 단계의 장점을 활용합니다. 고려해야 할 사항은 다음과 같습니다.
- TFF 또는 크로마토그래피 단계는 mRNA 공정 개발에서 자주 사용되는 용매 추출 및 침전 단계를 대체합니다.
- 가능한 경우 고품질의 화학물질과 엔도뉴클레아제가 없는 시약을 사용하여 mRNA 안정성을 개선하고 mRNA 분해 가능성을 최소화해야 합니다.
최근 몇 년 동안 대규모 환자 집단에 대한 mRNA 백신 출시에 큰 성공을 거두었습니다. 여전히 과제가 남아 있지만 고품질의 화학물질과 엔도뉴클레아제가 없는 시약을 사용하여 mRNA 안정성을 극대화하고 크로마토그래피 정제 기술을 최적화 및 맞춤화하여 분리를 극대화하고 스케일업을 간소화하는 데 중점을 둔 결과 GMP 제조 템플릿에 큰 진전이 있었습니다.
mRNA 기술이 잠재력을 최대한 발휘하려면 생산 규모에서 강력한 플랫폼이 발전할 수 있도록 혁신적인 솔루션, 전문성 및 독창성이 필요합니다. 당사는 제품, 서비스 및 기술 전문성을 바탕으로 고객의 mRNA 제조를 간소화하는 통합 솔루션을 개발하기 위해 최선을 다하고 있습니다.